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棘托竹荪菌盖蛋白提取及分析

[导读]首次以棘托竹荪菌盖为原料,通过单因素试验和正交试验,研究菌盖蛋白最佳提取工艺; 用SDS-PAGE测定所提取蛋白的分子量分布。

竹荪是一种营养丰富的食用菌,研究发现它具有抗氧化、抗菌及抗肿瘤等多种功效。竹荪中蛋白含量高,氨基酸种类齐全。华阳林等对国内不同地区的竹荪子实体进行测定,发现蛋白占竹荪子实体干重均值的17% 左右。屠六邦等通过实验测定竹荪子实体中含有21 种氨基酸,是食用菌中氨基酸种类最多的一种。竹荪子实体分为菌盖、菌群、菌柄、菌托四部分。菌盖鲜重占整个子实体20%左右,菌盖上附着有竹荪孢子。研究表明菌盖所含蛋白含量超过竹荪子实体, Jonathan SG 等测定发现竹荪菌盖干品中粗蛋白含量为25. 56%。然而,目前竹荪菌盖在竹荪采摘过程中被直接丢弃,未加以利用,造成了资源浪费和环境污染。本文通过对竹荪菌盖蛋白提取工艺研究,为提高竹荪资源综合利用,研发新的健康产品,减少环境污染和竹荪深加工及延伸其产业链提供技术依据。

1 材料与仪器

1. 1 主要试剂

NaOH、( NH4)2SO4、HCl,均分析纯,购于国药。蛋白Marker( 10 ~ 200kDa) ,由Thermo Scientific 提供。三羟甲基氨基甲烷( Tris) 、丙烯酰胺、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺、N,N,N',N'-四甲基乙二胺( TEMED) 、过硫酸铵、SDS、甘氨酸均由上海生工提供。

1. 2 主要仪器

320-S pH 计[梅特勒-托利多仪器( 上海) 有限公司]; Sigma 3-18K 离心机( 德国Sigma 公司) ; 鼓风干燥箱( 瑞士Salvis LAB) ; 小型垂直电泳系统,凝胶成像系统( 美国Bio-Rad 公司) ; KDN-103F 自动凯式定氮仪( 上海纤检仪器有限公司) 。


1. 3 实验材料

棘托竹荪( Dictyophora echinovolvata) ,源自福建省顺昌县。

2 实验方法

2. 1 实验材料预处理

新鲜竹荪采摘菌盖,利用去离子水洗去菌盖上附着的孢子。洗去孢子的菌盖于通风处沥去水分后粉碎,作为蛋白提取材料。后文中出现的菌盖均指洗去孢子粉碎的棘托竹荪菌盖。

2. 2 菌盖含水率测定

菌盖水分测定参考国标,并略作改进。取菌盖50. 000 g,放入干燥已称重的表面皿,置烘箱105℃烘至恒重。三次重复取平均值,计算菌盖含水率。

2. 3 菌盖蛋白提取单因素试验

2. 3. 1 料液比

250 mL 锥形瓶加入100 mL 去离子水,分别按料液比( w /v) 1∶ 5、1∶ 8、1∶ 10、1∶ 15 加入竹荪菌盖。用0. 1 mol /L NaOH 溶液调节pH 至8. 0,在55 ℃提取1h,6000 rpm 离心10 min 取上清液,测定蛋白含量,计算蛋白提取率。

2. 3. 2 pH

250 mL 锥形瓶加入100 mL 去离子水,以料液比1∶ 5 加入竹荪菌盖,用0. 1 mol /L NaOH 溶液分别调节pH 至7. 0、8. 0、9. 0、10. 0,55 ℃提取1 h。6000rpm 离心10 min 取上清液,测定蛋白含量,计算蛋白提取率。

2. 3. 3 提取时间

250 mL 锥形瓶加入100 mL 去离子水,以料液比1∶ 5 加入竹荪菌盖,用0. 1 mol /L NaOH 溶液调节pH 至9. 0,于55 ℃ 分别提取0. 5、1、2、4 h。6000rpm 离心10 min 取上清液,测定蛋白含量,计算蛋白提取率。

2. 3. 4 温度

250 mL 锥形瓶加入100 mL 去离子水,以料液比1∶ 5 加入竹荪菌盖,用0. 1 mol /L NaOH 溶液调节pH 至9. 0,分别于35、45、55、65 ℃提取2 h。6000rpm 离心10 min 取上清液,计算蛋白提取率。

2. 4 菌盖蛋白提取条件优化

在单因素试验基础上,考虑pH 值、时间、温度三个因素,采用3 因素3 水平L9( 34 ) 正交试验确定

最佳提取工艺条件,因素水平见表1。

2. 5 蛋白测定及提取蛋白分子量分析

2. 5. 1 菌盖粗蛋白测定及提取液中蛋白含量测定

蛋白测定参照国标[6],略作改进。菌盖粗蛋白测定为: 1 g 烘干菌盖粉末,加入定氮管中,加入20mL 浓硫酸,6g 催化剂( K2SO4 ∶ CuSO4·5H2O∶ Se =100∶ 10∶ 1) 。消化完全后消化液定容至100 mL,取10 mL 定容后的消化液用自动凯式定氮仪测定蛋白含量。提取液中蛋白测定: 取20 mL 提取液,加入20 mL 浓硫酸,6g 催化剂( K2SO4 ∶ CuSO4·5H2O∶ Se=100∶ 10∶ 1) 。消化后消化液定容至100 mL,取10 mL定容后的消化液用自动凯式定氮仪测定蛋白含量。


2. 5. 2 菌盖提取蛋白分子量分析

菌盖蛋白提取液用硫酸铵沉淀,6000 rpm,离心10 min 搜集沉淀,用PBS 缓冲液将沉淀溶解后,透析。透析操作参照王家郑的方法。透析后采用真空冷冻干燥,获得蛋白粉。利用SDS-PAGE 测定菌盖蛋白分子量,电泳参照辛普生的方法。

2. 6 统计分析

所有提取及分析过程重复三次,利用DPSv7. 05 软件对实验数据进行处理,作图采用Origin90SR2软件。

3 结果与分析

3. 1 菌盖蛋白提取单因素分析

3. 1. 1 料液比

由图1A 可以看出,料液比较高时,蛋白质的提取率较低。随着料液比的降低,蛋白提取率增加。这与固液传质理论相符合,料液比越小固体物质与液体接触面积越大,有利于物质溶出。但是,料液比的减少造成加入溶剂量增加,对于溶液后续的浓缩和干燥不利。在1∶ 5 的料液比时,粗蛋白的提取率是52. 14%,当料液比减少至1∶ 15 时蛋白提取率为56. 22%。溶剂量增加两倍,粗蛋白提取率仅增加4. 08%。这使得在后期蛋白分离和干燥上耗费大量的人力物力,在经济上得不偿失。所以在后面的试验中料液比选择1∶ 5。

3. 1. 2 pH 值

由图1B 可以看出,随着pH 上升,蛋白质的提取率上升,当pH 升至9. 0 时,蛋白质提取率最大达58. 02%,随后pH 上升蛋白提取率反而下降,这可能是由于竹荪中大部分氨基酸为酸性氨基酸,在碱性条件下容易溶解。但是碱性较强时破坏了蛋白质的性质,使维持蛋白质空间结构的氢键等非共价键遭受破坏,疏水基团暴露,使蛋白质变性,影响蛋白溶出,从而使粗蛋白提取率下降。而且常规的强碱法提取蛋白,容易造成氨基酸特别是赖氨酸的损失,产生一些有毒副产物,增加美拉德反应,这对蛋白的提取率有影响[9]。所以在后面单因素试验中pH 确定为9. 0,正交试验因素水平选用pH8. 0 ~ 9. 0。

3. 1. 3 提取时间

由图1C 可以看出,在2 h 内随着时间的延长,蛋白提取率明显上升,2 h 达最大,2 h 后蛋白提取率基本保持不变。当提取时间小于2 h 时,随着提取时间的增加,竹荪细胞内部温度不断升高,水分汽化产生的压力使细胞膜及细胞壁破碎,有利于溶剂进入细胞,使蛋白容易溶出。当提取时间超过2 h时,大部分蛋白已经溶出,提取率基本稳定。所以在后面单因素试验中提取时间确定为2 h,正交试验因素水平选用1. 5 ~ 2. 5 h。


3. 1. 4 温度

由图1D 可以看出,35 ~ 45 ℃之间蛋白的提取率增加显著,从45 ℃开始,随着温度的升高,蛋白的提取率增幅明显趋缓。大多数蛋白质的溶解度在0~ 40 ℃范围内随着温度的上升而升高,竹荪菌盖蛋白在35 ~ 45 ℃之间的溶解度变化也符合上诉理论。随着温度上升,由于高温使疏水基团暴露,从而使蛋白质发生变性。蛋白质变性往往失去溶解度,因此在45 ℃之后蛋白提取率基本稳定。正交试验因素水平选用45 ~ 55 ℃。


3. 2 菌盖蛋白提取正交试验分析

由单因素试验得出料液比虽然影响竹荪菌盖蛋白的提取率,但是从实验溶剂及实验费用的消耗等考虑,料液比宜控制在相对较大的范围。为此在正交试验中料液比固定为1∶ 5,未对料液比进行研究。正交试验结果见表2,由极差分析可得,3个因数的极差大小顺序为RB > RA > RC,影响菌盖提取工艺的主要因数是提取时间,其次是pH,温度对其影响最小。方差分析结果表明提取时间对菌盖蛋白提取影响极显著( P < 0. 01) ,pH 对菌盖蛋白提取影响显著( P < 0. 05) ,温度对菌盖蛋白提取影响不显著。最优提取条件为A2B3C3,即: pH8. 5,提取时间2. 5 h,提取温度55 ℃。经实验验证,该条件下提取率达到64. 07%。


3. 3 菌盖蛋白分子量测定

样品蛋白浓度10 mg /mL,用15% 的分离胶,采用银染方案对凝胶进行染色。利用Bio-Rad 凝胶成像仪分析竹荪菌盖蛋白的分子量,结果见图2。主要蛋白分子量为16 和38 kDa,分子量为12、23、32、70、90 kDa 的蛋白含量相对较少。在23 ~ 32 kDa、38 ~ 70 kDa 之间还有一些非常暗的条带,由于条带不明显,无法判断其分子量。


4 结论

本实验通过单因数试验和正交试验对竹荪菌盖蛋白的提取工艺进行探索和优化,确定了竹荪菌盖总蛋白最佳提取条件为: pH8. 5,提取时间2. 5 h、温度55 ℃,菌盖蛋白提取率64. 07%。提取的蛋白经SDS-PAGE 测定,发现菌盖蛋白分子量分布为12 ~90 kDa,其中16 kDa 和38 kDa 的蛋白为主要蛋白,其他分子量蛋白含量相对较少。

本文首次以棘托竹荪菌盖为原料研究了蛋白提取工艺,证明了棘托竹荪菌盖用于提取蛋白的可行性。通过SDS-PAGE 测定了菌盖蛋白分子量,初步了解菌盖蛋白的组成,为竹荪资源合理利用、竹荪新产品开发及提高农产品附加值提供了依据。棘托竹荪菌盖蛋白的结构分析,生理生化性质正在进一步的研究之中。

















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