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考马斯亮蓝法测定核桃水溶性蛋白含量的研究

[导读]采用考马斯亮蓝G-250染色法对核桃粗蛋白中可溶性蛋白质含量进行了测定,结果表明,蛋白质浓度为10mg/mL~80mg/mL时与吸光度值有良好的线性关系,考马斯亮蓝G-250染色法简单、快速、灵敏,且相对较为准确,是定低浓度蛋白质含量的有效方法。通过此方法,测得的核桃水溶性蛋白平均含量为8.37%。

近年来,基因工程学、分子生物学和现代分离技术快速发展,蛋白质也作为一项质量和资源评价的指标,目前测定蛋白质含量的常用方法有凯氏定氮法、考马斯亮蓝(coomassie brilliant blue,CBB)染色法、紫外分光光度法、双缩脲法、Folin-酚试剂法(Lowry法)等,有关文献报道CBB法优于其他的方法

牛血清白蛋白是极为常用的标准参照蛋白,其质量限定条件一般要求蛋白质含量在80%以上(凯氏定氮法测定)。在10d~50d范围内,以凯氏定氮法测定的牛血清白蛋白质含量未见明显规律性变化,但呈下降趋势;而氨基酸含量呈逐渐增加趋势,表明在4℃条件下牛血清白蛋白存在降解现象。因此,牛血清白蛋白溶液配好尽快做标准曲线。在利用分光光度计测量吸光度值时,所用的比色皿应该是塑料的或玻璃的。并且用之前应绝对保证清洗干净,禁止使用石英(成分为二氧化硅)比色皿,因为染料会跟二氧化硅发生共价结合[10]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试样品为核桃蛋白(实验室自制);牛血清白蛋白:购于Solarbio公司;考马斯亮蓝G-250:购于Beyotime公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

UV2550紫外可见分光光度计:日本岛津公司;TDL-40B离心机:上海安亭科学仪器厂;FW177粉粹机:天津泰斯特仪器有限公司;101-3A鼓风干燥箱:上海博讯实业有限公司医疗设备厂;JA1003N电子精密天平:奥豪斯仪器(上海)有限公司。

1.3 实验原理

考马斯亮蓝G-250存在着红色和蓝色2种不同的着色形式。蛋白质分子具有酰胺基结构,其和蛋白质通过分子间范德华键结合,染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式,最大吸收波长由465nm变成595nm,通过测定波长595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

1.4 实验方法

1.4.1 考马斯亮蓝G-250的制备

精确称取100.00mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL 90%vol乙醇中,加入100mL 85%的磷酸,用水稀释至1000mL。快速过滤后,放在棕色试剂瓶中避光保存。最终试剂中含0.1g/L考马斯亮蓝G-250,47g/L乙醇,85g/L磷酸。

1.4.2 标准蛋白质溶液的制备

结晶牛血清白蛋白,预先经微量凯式定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度配制成1mg/mL标准溶液。

1.4.3 供试样品溶液的制备

精确称取处理好的核桃粗蛋白粉0.5002g,加入蒸馏水溶解,在室温条件下搅拌浸提1h,然后3500r/min离心20min,过滤上清液。然后加少量蒸馏水对沉淀进行再次水提,操作条件与前者相同。合并2次所得的上清液,定容至100mL,备用。

2 结果与分析

2.1 标准曲线回归方程建立

取9支试管,分别加入0、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL的1mg/mL标准蛋白质溶液,补水至2.0mL。另取9支试管,分别加入0.1mL以上溶液,然后各加入5mL考马斯亮蓝试剂,充分振荡混合,10min后于波长595nm处,以0号管为空白,测定各管的吸光度值。以标准蛋白质浓度(X)为横坐标,吸光度值(Y)为纵坐标绘制标准曲线,结果见图1。

得其线性回归方程式:


Y=0.87249X-0.00056,R2=0.99964,r=0.99982

2.2 供试样品中蛋白质含量的测定

取样品溶液0.1mL于试管中,各加入5mL考马斯亮蓝试剂,充分混合,放置10min,以试剂空白为对照,波长595nm处比色,测定吸光度值。同时做3个重复,测得吸光度值分别为0.372、0.377、0.345,计算蛋白质含量分别为8.54%、8.66%、7.92%,平均含量为8.37%。

2.3 稳定性实验

量取同一样品溶液0.1mL,每隔5min测定一次,观测其稳定性,结果见表1。

由表1可知,在显色5min~25min内吸光度值比较稳定,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为0.67%,小于5%,表明稳定性较好。

2.4 精密度实验

精确吸取牛血清白蛋白溶液0.1mL进行精密度实验,连续测定其吸光度值6 次,结果见表2。由表2可知,RSD为1.62%,小于5%,表明精密度较好。

2.5 重现性实验

精确吸取来自同一批原料的试样,按样品测定方法,分别测定其吸光度值,结果见表3。

由表3可知,RSD为2.36%,小于5%,表明重现性较好。

2.6 回收率实验

精确吸取已配制的样品溶液1mL,分别加入0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL蛋白质标准溶液,加蒸馏水补足至2.0mL,按照样品测定法测吸光度值,计算回收率,结果见表4。

由表4可知,RSD为2.77%,小于5%,表明该方法准确度较高,实验方法可行。

3 结论

供试样品溶液中蛋白质含量为0.1mg/mL~0.8mg/mL内时,在25min之内用考马斯亮蓝染色法测定其中的蛋白质含量,方法简便快速、灵敏度高、重现性好,对设备要求低,是测定蛋白质的有效方法。




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