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碱性蛋白酶制备纳米珍珠粉工艺优化

[导读]使用碱性蛋白酶处理,考察摇床转速、酶解时间和加酶量对纳米级珍珠粉得率的影响. 试验结果表明: 10g 珍珠粉加入50 mL 去离子水,在摇床转速为180r/min、酶解时间为8 h、酶用量为0.5g 时,纳米级珍珠粉得率为95.2 %. 凯式定氮实验表明: 酶解前后珍珠粉蛋白质的含量分别为24.132 % 和22.010 %,酶解后仅相对减少了0.088.

珍珠是贝类软体动物体内的产物,主要由其体内的外套膜受刺激后珍珠囊细胞分泌出珍珠物质,经积累、包裹后形成的. 珍珠的主要成分为碳酸钙、氨基酸、多种微量元素和卟啉类化合物( PEG) 等. 珍珠已成为卫生部批准的作为食品新资源使用的物质之一,使得珍珠在原有药物成分上使用范围将更加广泛.珍珠粉颗粒越细越容易被人体吸收,纳米珍珠粉( 55%以上的颗粒粒度小于1 微米的珍珠粉) 的粒径为毛孔的万分之一,更是毛细血管的末端的四分之一到八分之一,人体吸收率高. 但是,由于珍珠具有坚硬的同心叠层结构,加工成纳米粉相当困难,传统的加工方法容易使珍珠营养成分受到破坏或溶解;同时产品粒度大,内服或外用肠胃及皮肤吸收率派,药效及美容效果受到很大影响.纳米珍珠粉常用制备方法包括化学制备方法和物理制备方法. 但无论是化学方法还是物理方法都容易造成蛋白质的损失,或者对设备要求高,难以在保证细度、蛋白质含量不损失的同时扩大生产.本文利用碱性蛋白酶降解处理珍珠粗粉,考察酶解过程中摇床转速、酶解时间和加酶量与纳米级珍珠粉得率的关系,并对酶解前后珍珠粉蛋白质含量进行测定.

1 材料与方法

1. 1 仪器与试剂

电子天平( 上海民桥精密科学仪器有限公司) 、DSHZ - 300A 型旋转式恒温振荡器( 江苏金城国盛实验仪器厂) 、K9860 全自动凯氏定氮仪( 海能( 济南) 仪器有限公司) 、数显鼓风干燥箱( 上海华睿仪器有限公司) 、KDN - 08C 消化炉( 上海华睿仪器有限公司) 、H800 型显微镜( 日本日立公司) .粗珍珠粉( 50 目) ,华伊美科技有限公司提供; 碱性蛋白酶,无锡杰仁生物科技有限公司提供; 硫酸铜、硫酸钾、氢氧化钠、硼酸、盐酸、浓硫酸,上海苏懿化学试剂有限公司提供,均为分析纯.

1. 2 实验方法

1. 2. 1 粒径测定方法通过显微镜观察,采用棋盘抽样[6]方法统计每个抽样圆中小于1 μm 的珍珠粉颗粒数,再与总颗粒数相比,即得小于1 μm 的颗粒百分数. 棋盘法抽样见图1,图中大圆为目镜视野范围,划线后在棋盘节点处各取一个直径为5 μm 的圆,为抽样圆.观测所用的显微镜为光学显微镜,放大倍数为10 × 40,物镜测微尺的刻度为1 μm,其一格对应目镜测微尺4 格,即目镜测微尺的刻度为250 nm.

1. 2. 2 制备工艺流程纳米级珍珠粉的酶解制备工艺流程见图2 所示.

1. 2. 3 制备工艺优化分别考察摇床转速、酶解时间和酶用量对纳米级珍珠粉得率的影响,设计正交实验确定纳米珍珠粉最优制备条件,因素水平表如表1 所示.

1. 2. 4 蛋白质测定采用我国国家标准GB /T 5009. 5—2010[7]中第一法凯式定氮法测定酶解前后珍珠粉中蛋白质含量.

蛋白质含量的计算公式为: P( %) = N( %) × C, ( 1)

N( %) = ( 1. 401 × M × ( V - V0) ) ÷ W, ( 2)

式中: M 为标准酸的摩尔浓度( mol /mL) ; W 为样品的重量( g) ; V0为空白样滴定标准酸量消耗量( mL) ; V为样品滴定标准酸消耗量( mL) ; C 为粗蛋白转换系数,为6. 25.

2 结果与分析

2. 1 酶解最优条件的确定经过摇床转速、酶解时间和酶用量三个因素的单因素实验,初步确定提取参数的范围,设计正交实验采用L9

( 34 ) 正交表进行实验,实验结果与极差分析见表2 所示.

根据我国国家标准( 征求意见稿) 规定,当小于1 μm( 范围内体积%) 的珍珠粉含量不小于55%时,即视为纳米级珍珠粉. 因此,由正交试验结果可知,A1B3C3、A1B2C2、A2B3C1、A2B1C2、A3B3C2、A3B1C3 和A3B2C1 实验组和均能达到国标的要求,其中A1B3C3、A1B2C2 和A3B1C3 实验中超过80%的珍珠粉粒径小于1μm,又以A1B3C3 结果最佳. 试验结果见表2 及图3 所示.

通过极差分析可知: 各因素对纳米珍珠粉得率影响的主次顺序为A( 摇床转速) > C( 酶用量) > B( 酶解时间) . 相对于酶用量和酶解时间,摇床转速对纳米珍珠粉的得率影响更大,这是由于珍珠粗粉粒度小,分散度较差,若转速低珍珠粗粉则难以和蛋白酶充分接触,酶解反应只能发生在粉层表面; 高速的振摇可将珍珠粗粉与碱性蛋白酶完全混合,使酶解反应进行彻底,从而大幅度提高酶解的效率.最佳实验组和为A1B3C3,即当摇床转速为180 r /min、酶解时间为8 h、酶用量为0. 5 g 时,纳米珍珠粉的得率可达到95. 2 %. 通过显微镜观察,见图3,可以发现最佳组合条件下纳米珍珠粉的粒度分散更为均匀.


2. 2 酶解前后蛋白质含量的变化

通过凯式定氮法得到酶解前后珍珠粉的蛋白质含量分别为24. 132 %和22. 010 %,酶解后珍珠粉蛋白质含量约下降2. 122%,相对减少0. 088( 相对减少量= [( 酶解前蛋白质含量—酶解后的蛋白质含量) /酶解前的蛋白质含量]) .酶解过程的温度为40℃,条件温和,不会引起蛋白质变性损失. 而物理研磨处理过程中的高热和化学分解处理中添加的化学试剂都会不同程度的引起大量蛋白质损失.

3 结论

本文以珍珠粉粒径为考察指标,采用生物酶法,研究摇床转速、酶解时间和加酶量对纳米级珍珠粉得率的影响. 可知: 当摇床转速为180 r /min、酶解时间为8 h、酶用量为0. 5 g 时,纳米级珍珠粉的得率为95. 2%. 由凯式定氮实验得酶解后珍珠粉蛋白质相对减少量小于0. 1. 酶法制备纳米级珍珠粉操作简单、处理量大、得率高、蛋白质损失小,适宜推广.




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