KDN-103A  HYP-308消化炉 上海纤检仪器有限公司
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凯氏定氮法方格星虫多糖中蛋白质的含量

[导读]建立一种快速、简单、准确测定方格星虫多糖中蛋白质含量的方法。综合考虑,凯氏定氮法简便、快速、准确,可用于方格星虫多糖中蛋白质的质量控制。

方格星虫 Sipunculus nudus Linnaeu 俗称沙虫, 是星虫动物门方格星虫目方格星虫科方格星虫属的 裸体方格星虫的全体。现代医学研究表明方格星虫含有丰富的多糖、蛋白质、微量元素等活性物质,海 洋星虫的保健功能在我国古代医药专著《海药本 草》和《本草纲目》中均有记载。除作食用外,民间 还把它作为治疗虚火上炎及滋阴补肾之食疗药物, 一般用于目赤、面部潮红。夏日盛暑因烈日暴晒、身 体发热、便秘的患者,用之可缓解症状,因疲劳过度 四肢乏力,多服可精神焕发、精力迅速恢复,故闽南 人称之为“动物人参”。沿海民间常用以取代昂贵 的冬虫夏草,因而又被称为“海洋里的冬虫夏 草” [1] 。方格星虫多糖是从方格星虫中提取分离得 到的一种提取物,药效学研究结果表明该提取物在 促智[2]、抗疲劳[3]、抗辐射[4]、提高免疫力[5]等方面具有显著的功效。我课题组前期对其提取工艺进行 过优化[6],提取方法主要是传统的水提醇沉法[7], 该提取物除含有多糖之外,蛋白也是其活性成分之 一,快速、简单、准确地对其中的蛋白质含量进行测 定,这对于方格星虫多糖提取物的开发应用和质量 控制具有重要的意义。 目前关于方格星虫多糖中蛋白质含量的测定方 法未见报道,为此,我们采用了凯氏定氮和考马斯 亮蓝2 种方法进行研究,为方格星虫多糖的质量控 制奠定基础,也为其新药申报项目资料,提供必要的 实验方法和数据。 

1 材料 KDN103F 型凯式定氮仪( 上海纤检仪器有限 公司) ,方格星虫多糖( 实验室自制) ,考马斯亮蓝 G250 ( AR 级,中国医药集团上海化学试剂公司,批号 20010910) ,牛血清白蛋白对照品( BSA,生化试剂, 上海伯奥生物科技有限公司,批号 050912) ,硫酸铜 ( AR 级,生工生物工程有限公司,批号 3498B008) , 硫酸钾( AR 级,上海振欣试剂厂,批号 20070403) , 浓硫酸( AR 级,中国医药集团上海化学试剂公司, 批号20020412) ,葡萄糖( AR 级,上海化学试剂分装 厂,批号0690404) 。 

2 方法与结果 

2. 1 凯氏定氮法 

2. 1. 1 实验原理[89] 蛋白质是含氮的有机化合 物,样品与硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分 解,分解的氨与硫酸组合成硫酸铵,然后碱化蒸馏使 氨游离,用硼酸吸收,再用已知摩尔浓度硫酸标准溶 液滴定,根据硫酸消耗量乘以换算系数,即为蛋白质 含量。

 2. 1. 2 精密度试验 精密称量( NH4) 2SO4 共 6 份,照上述方法进行测定,结果氮平均含量 12. 50 mg, RSD 3. 54%,表明仪器精密度良好。 2. 1. 3 重复性试验 精密称取星虫多糖0. 3 g,共 6 份,照上述方法进行测定,氮平均含量 0. 38%, RSD 3. 39%,表明重复性良好。 2. 1. 4 加样回收试验 精密称取星虫多糖( 已测 定含氮量,含氮量为 0. 38%) 0. 3 g,共 6 份,分别置 干燥的消化管中,再依次精密加入( NH4) 2SO4 30 mg,按以上试验步骤操作,测定含氮的总量,计算回 收率,测定结果见表1。 2. 1. 5 样品的含量测定 精密称取 3 批星虫多糖 0. 3 g,每批 3 份,共 9 份,照上述方法进行测定,测 定氮含量乘以换算系数 6. 25[10],即得蛋白含量,结2. 2 考马斯亮蓝法[11] 

2. 2. 1 实验原理 蛋白质分子均具有酰胺基团,棕 红色的考马斯亮蓝G250 染料上的阴离子与蛋白质 的酰胺结合,使溶液变为蓝色,其最大吸收峰为 595 nm,蛋白质在 1 ~ 1 000 μg 其吸光度与蛋白质 含量成正比,故可用于测定蛋白质含量[1213] 。 

2. 2. 2 供试品溶液制备 精密称取 3 批海洋星虫 多糖30 mg,分别置50 mL 量瓶中,加水超声溶解并 稀释至刻度,摇匀,即得。 

2. 2. 3 蛋白质标准溶液的制备 精确称取牛血清白 蛋白10. 0 mg,用少量蒸馏水溶解定容至100 mL,即 为0. 1 g·L -1蛋白质标准液, 4 ℃冰箱中保存。 

2. 2. 4 考马斯亮蓝 G250 溶液的制备 精密称取 考马斯亮蓝 G250 100. 0 mg 加入95%乙醇 50 mL, 再加入 85% 磷酸 100 mL,最后用蒸馏水定容至 1 000 mL,最终试剂含 0. 01% 考马斯亮蓝 G250, 4. 7%乙醇,8. 5%磷酸,置于棕色瓶中备用。 

2. 2. 5 标准曲线的制作 分别精密吸取蛋白质标 准溶液0, 0. 2, 0. 4, 0. 6, 0. 8, 1. 0 mL 置于 10 mL 具 塞试管中,分别加蒸馏水至 1 mL,加入考马斯亮蓝 G250 溶液5 mL 混匀,放置10 min,于595 nm 处测 吸光度,回归方程为 Y = 0. 215 3X - 0. 0135( R2 = 0. 998 8) 。 

2. 2. 6 稳定性试验 取同一供试品溶液1 mL,每 隔 10 min 测定 1 次,考察其稳定性,得 RSD 2. 08%,结果表明在显色60 min 时间内吸光度稳定 性较好。 

2. 2. 7 精密度试验 精密吸取标准溶液( 100 mg·L -1) 0. 5 mL 进行精密度试验,连续 6 次测定其吸 光度,得 RSD 1. 58%,表明精密度好。 

2. 2. 8 重复性试验 精密吸取来自同一批海洋星 虫多糖样品6 份,按样品测定方法,分别测定其吸 光度,检验该测定方法的重复性,得 RSD 2. 63%, 表明重复性较好。

2. 2. 9 回收率试验 取已知含量的样品溶液1 mL ( 蛋白含量为 2. 13%) ,分别加入 0. 3 mL 蛋白质标 准溶液,照样品测定方法操作,经计算平均回收率为 100. 97%, RSD 2. 1%,结果见表3。 

2. 2. 10 样品中蛋白质含量的测定 取3 批供试品 溶液各1 mL,同时做3 个重复,以空白试剂为参比, 按上述标准曲线的测定法,分别测定其吸光度,计 算样品中蛋白质的含量, 3 批样品含量依次为 2. 13%, 2. 34%, 2. 19%。 3 讨论 2 种方法对海洋星虫多糖中蛋白质含量的测定 结果表明,凯氏定氮法略高于考马斯亮蓝法,但无显 著性差异。凯氏定氮法适用范围广泛,测定结果准 确,重复性好,但操作复杂费时,试剂消耗量大。在 本实验中采用模块式消化炉代替传统的消化装置, 可同时测定8 份样品,大大提高了工作效率,适用于 批量蛋白质的测定,具有准确、快速、简便、低耗、稳 定的优点。考马斯亮蓝 G250 与蛋白质结合反应十 分迅速, 2 min 左右即达到平衡,其结合物室温下1 h 内基本保持稳定,但在 5 ~ 20 min,颜色的稳定性最 好,但在 20 min 之后线性略有降低,会对实验带来 误差。 凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用 的方法,是测定试样中总有机氮最准确和最简单的 方法之一,被国际国内作为法定的标准检验方 法[14]。用凯氏定氮法对方格星虫多糖进行样品测 定时,要控制好消化时间,时间过短,则样品未完全 消化,致使结果偏低;时间过长,结果也会偏低,这可 能是因为小部分氮随水蒸汽一起逸出引起的,因此本实验通过多次摸索,确定消化时间为1. 5 h。 在凯氏定氮法测定时产生 SO2 等有害气体,但 采用减压真空泵可将有害气体溶解于水中,从而有 效避免空气污染。 综上所述,经过对上述 2 种蛋白质含量测定方 法进行对比,考马斯亮蓝法比凯氏定氮法结果偏低, 最终确定凯氏定氮法作为方格星虫多糖中蛋白质含 量的测定方法。






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