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凯氏定氮法测定刺槐花中蛋白质含量

[导读]目的 :测定辽宁省不同产地刺槐花及花蕾中蛋白质的含量,为刺槐花的品质评价与资源开发利用提供 科学依据。方法 :依据《中华人民共和国药典》2010年版第三部附录VIA氮测定法,采用凯氏定氮法(半微量法)对 辽宁省不同产地的刺槐花和花蕾进行蛋白质含量测定,并比较花和花蕾中蛋白质含量的差异。

刺槐(Robinia pseudoacacia L.)又名洋槐,为 豆科(Leguminosae)刺槐属植物,以花入药,药材 名为刺槐花。中医认为,刺槐花性味涩、平,有小 毒,入肝经,有收敛止血的功效,多用于治疗咯血、 大肠下血,又治妇女崩漏等症[1]。刺槐花的止血功 效与《中华人民共和国药典》收载的同科植物槐 花(Flos Sophorae)具有同等功效[2],因此好多地方 常把刺槐花作为槐花的替代品在临床上使用。刺 槐分布广泛,全国各地均有栽培,辽宁省刺槐资源 非常丰富。刺槐不仅分布广泛,用途也十分广泛, 不仅药用,嫩叶花还可以食用,现已成为一种城市 居民的绿色蔬菜。从现代营养学角度来说,刺槐 花中含有丰富的蛋白质、糖、氨基酸、酶及多种微 量元素[3]。其中蛋白质是人体三大营养素之一,是 一切生命的物质基础,是构成人体新生组织、维持 人体健康的重要成分,它的化学元素为C、H、O、N, 含氮是其区别于其他营养物质——糖类和脂肪的 主要标志。文章依据《中华人民共和国药典》(2010 年版)第三部附录VIA 凯氏定氮法(半微量法) ,对 辽宁省10个不同产地刺槐花与花蕾中蛋白质的含 量进行测定,为评价刺槐花与花蕾的品质评价和 资源开发利用提供依据。 

1 实验材料 

1.1 试剂 硫酸铜(鑫 科 股 份 合 肥 工 业 大 学,批 号 : 20001101);硫酸钾(宜兴市第二化学试剂厂,批号 : 20011101);硫酸(北京北化精细化学品有限公司, 批号 :100613);氢氧化钠(国药集团化学试剂有限 公司,批号:20041216);硼酸(沈阳新兴试剂厂,批 号:2010年11月14日);甲基红(天津市科密欧化学 试剂有限公司,批号:2009年3月30日);溴甲酚绿 (国药集团化学试剂有限公司,批号:F20100520); 蒸馏水。所用试剂均为分析纯。 

1.2 仪器 ALC-110.4型电子分析天平(北京赛多利斯仪 器系统有限公司) ,消化炉,酸式滴定管,定氮装置, 容量瓶。 

1.3 材料 本实验材料采自辽宁省辽阳 、盘锦、本溪、 抚顺、丹东、大连、鞍山、庄河、兴城、营口等地, 经辽宁中医药大学药学院初正云教授鉴定,为 豆科(Leguminosae)刺槐属植物刺槐(Robinia pseudoacacia L.)的干燥花及花蕾。 

2 方 法  

2.1 原理(凯氏定氮法) 蛋白质是含氮的有机化合物。刺槐花中含氮的 有机化合物与硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白 质分解,分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱 化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后再以盐酸标准溶液 滴定,酸的消耗量乘以换算系数,即为蛋白质含量。

反应式为 : 消 化 : 2NH2+H2SO4→(NH4) 2SO4+SO2↑+CO2 ↑+H2O 蒸馏 :(NH4) 2SO4+2NaOH→Na2SO4+2H2O+2NH3 ↑ 2NH3+4H3BO3→(NH4) 2B4O7+5H2O 滴 定 : (NH4)2B 4O 7+2HCl+5H2O→ 2NH4Cl+4H3BO3 2.2 试剂的配制 2.2.1 混合指示剂配制 ①溶液A:0.1g溴甲酚绿溶于95% 乙醇,并用 乙醇稀释至100mL ;②溶液B :0.2g甲基红溶于95% 乙醇,并用乙醇稀释至100mL ;③取30mL溶液A和 10mL溶液B混合即可。 

2.2.2 硼酸吸收液配制 2 g 硼酸溶于100mL热水中。 

2.2.3 40%氢氧化钠溶液配制 40g 氢氧化钠溶于100mL水中。 

2.3 测定 

2.3.1 消化 精密称取样品2.0g于500mL干燥的凯氏定氮瓶 中,加入硫酸钾6.0g、硫酸铜 0.2g以及浓硫酸20mL, 稍摇后于瓶口放一小漏斗,将瓶以45°角斜支于 有小孔的石棉网上,小火加热,待内容物全部炭化, 泡沫完全停止后,加大火力,并保持瓶内液体微沸。 随时转动烧瓶,使瓶壁上的内容物全部流入消化 液中,至液体呈蓝绿色澄清透明后,再继续加热约 40min,取下放冷,加入20mL蒸馏水,移入100mL容 量瓶中,用蒸馏水洗涤定氮瓶,洗液并入容量瓶中, 再加水定容至刻度,摇备用。取与处理样品相同 量的硫酸钾、硫酸铜、浓硫酸按同一方法做空白对照 试验。 2.3.2 蒸馏 装好定氮蒸馏装置,于水蒸气发生瓶内装水 约2/3处,加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸, 以 保持水呈酸性,再加入数粒玻璃珠以防暴沸,加热 煮沸水蒸气发生瓶内的水。量取2%硼酸吸收液 10mL置150mL的锥形瓶内,滴加混合指示液3~5 滴,并使冷凝管下端插入液面下,吸取10.0mL样品 消化液由小玻璃杯流入凯氏蒸馏器内,并以10mL 水洗涤小玻璃杯,使流入反应器内,塞紧小玻璃杯 的棒状玻璃塞。再将10mL 40%氢氧化钠溶液倒 入小玻璃杯,提起玻璃塞使其缓慢流入反应室,立 即将玻璃盖塞紧,并加水于小玻璃杯以防漏气。 夹紧夹子,开始蒸馏,蒸气通入反应室使氨通过冷 凝管进入接收瓶内。从第一滴蒸馏液滴下起计时, 蒸馏 5min后,移动接收瓶,使冷凝管下端离开液 面,再蒸馏 1min,使氨全部蒸出,可用精密pH试纸 测冷凝管口的冷凝液来测定蒸馏是否完毕,中性 则说明已蒸馏完全。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部,取下接收瓶。同时吸取10.0mL试剂空白 消化液按上述方法操作。 

2.3.3 滴定 用0.05mol/L盐酸标准溶液进行滴定,至溶液由 蓝绿色变为灰红色即为终点,并对滴定液的结果用 空白试验校正。 

2.3.4 计算

式中:W—蛋白质含量(%);Vo—空白滴定 消耗标准酸溶液的体积(mL);Vx—样品滴定消耗 标准酸溶液的体积(mL);c—盐酸标准溶液的浓 度(mol/L ;0.014):氮的毫摩尔质量(g/mmol);m— 样品质量(g);F:氮换算为蛋白质的系数 ;蛋白质 中的氮含量一般为15%~17.6%,按16%计算乘以 6.25即为蛋白质。 3 结 果 刺槐花来源于刺槐的干燥花及花蕾,本实验对 不同产地的刺槐花和花蕾分开进行蛋白质测定。通 过实验得到,辽宁省不同产地刺槐花中蛋白质含 量高的为盘锦29.07%,含量低的为丹东东港 25.73%,平均含量27.23% ;刺槐花蕾中蛋白质含量 高为瓦房店34.55%,低为大连大黑山28.85%, 平均含量31.52%。由此可得出结论,刺槐花蕾中蛋 白质平均含量要高于刺槐花中约2.67%。具体实验 数据见表1~2。采用SPSS13.0进行方差分析,刺槐花和刺槐花 蕾中蛋白质含量之间有显著性差异( P <0.05);10个 产地刺槐花蛋白质含量之间差异不显著( P >0.05), 10个产地刺槐花蕾中蛋白质含量之间也无显著性差异( P >0.05)。

4 注意事项及讨论 (1)称取的样品倒入定氮瓶内时,不要沾附在 瓶颈上,以免加入消化液后试样炭化黏在瓶颈上消 化不彻底,造成测定结果偏低。若有此情况发生,需 用少量蒸馏水将其冲于底部。 (2)消化过程中要逐渐升温,当低温加热至出 现大量白色气体时,才可升温使溶液沸腾。消化过 程中要经常转动凯氏瓶,将溅到瓶壁上的黑渣全部 浸入凯氏烧瓶底部的消化液中,以避免由于消化不 完全使测定结果偏小。 (3)蒸馏时,加入的氢氧化钠溶液除与硫酸铵 作用外,还与消化液中的硫酸和硫酸铜作用。若 加入的氢氧化钠不够,则溶液呈蓝色,不生成褐色 的氢氧化铜沉淀。所以,加入的氢氧化钠溶液必 须过量,并且在加入时动作要迅速,以防止氨的流 失[4]。 (4)蒸气发生瓶内的水装至 2/3体积并且保持 酸性(在蒸气发生器中的水中加入数滴硫酸和数滴 混合指示剂,保持水呈粉红色,如变黄时,应该及时 补加酸) ,以防止水中有氨态氮蒸出,从而使测定结 果偏大。 (5)在进行下次蒸馏前,要使反应室充分冷却, 用冷水或湿布冷却反应室,使其温度降到不烫手为 止。在反应室没有充分冷却的情况下就进行下次蒸 馏,因加入的氢氧化钠和浓硫酸反应也会放出大量 的热,容易产生暴沸,可能会使反应液冲入冷凝管, 造成实验失败[5-7]。 

5 结 论 

通过对辽宁省不同产地刺槐花和花蕾中蛋 白质含量进行测定,刺槐花中平均蛋白质含量为 27.23% ;刺槐花蕾中平均蛋白质含量为31.52%。刺 槐花蕾中的蛋白质含量明显大于刺槐花中的蛋白质 含量( P <0.05)。 各产地刺槐花及花蕾中蛋白质含 量相对稳定,为刺槐花的品质评价和应用价值提供 科学依据,为其进一步的开发利用提供技术资料。 采用凯氏定氮法测定刺槐花中蛋白质含量,方法稳 定可靠,偏差较小,重现性好[8-9]。



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