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杜马斯燃烧法测定油料粗蛋白含量

[导读]杜马斯燃烧法与凯氏定氮法测定结果呈显著线性相 关( 线性相关系数为0. 998 8, P < 0. 001) ,杜马斯燃烧法与凯氏定氮法在测定样品粗蛋白时无显著性差异( P > 0. 05) ,并且燃烧法变异系数 CV 小于0. 6%,测定结果准确、重现性好,更适用于油料样品粗蛋白含量检测。

食物中的动物和植物蛋白是人体营养的重要来 源。大豆、花生、油菜籽等油料不仅是食用油脂重要 来源,同时还为人类提供优质的蛋白[1]。大豆蛋白 质功能特性好、营养价值高、用途广泛[2]; 花生含有 25% ~30%粗蛋白,与其他植物蛋白相比,其消化系 数高达90%,易被人体吸收利用[3],对人体健康和慢性病防治有重要作用[4]; 油菜籽蛋白质为完全蛋 白质,其氨基酸组成模式良好,符合 FAO 推荐需 求[5],营养品质可与动物蛋白质相媲美[6]; 同时,菜 粕( 菜籽饼粕) 是一种价廉易得的优质蛋白饲料资 源,在畜禽、水产等养殖领域广泛应用[7]。因此,油 料粗蛋白含量是油料品质的重要参数。

油料粗蛋白含量的测定方法主要有凯氏定氮 法、杜马斯燃烧法、分光光度法、滴定法等。分光光 度法简单迅速,灵敏度低。滴定法在操作过程中主 要是实验者利用肉眼进行判断容易发生疏失误差。 目前,国内外常规检测方法是凯氏定氮法,该方法结 果准确、重现性好,但在样品前处理消化过程中使用 强酸、强碱,操作繁琐、费时,产生二氧化硫、氨气对 人体有害且污染环境。随着人们对环境保护意识的 日益增强,促使人们寻求新的检测方法。杜马斯燃 烧法前处理简单、省时,能够自动连续大批量检测, 具有环境友好、安全等特点,是未来油料粗蛋白含量 测定的发展趋势。本研究以大豆、花生、油菜、芝麻 和菜粕等油料为研究对象,优化包括称样量、粉碎细 度、氧气因子和氧气流量组合等在内的参数,建立杜 马斯燃烧法测定油料中粗蛋白的方法,旨在为高含 油高蛋白油料样品快速测定提供新途径。 1 材料与方法

1. 1 材料 油菜籽、大豆、花生、芝麻和菜籽饼粕样品由农 业部油料及制品质量监督检验测试中心提供,为不 同年份、不同主产区生产的油料产品样品。

1. 2 主要仪器与试剂 NDA - 701 杜马斯定氮仪( 意大利 VELP 公 司) ; UDK -152 凯氏定氮仪( 意大利 VELP 公司) ; CPA -224S 电子分析天平( 德国 Sartorius 公司) ; ZM -100 粉碎机( 德国 Retsch 公司) ; 10 目、 20 目、 40 目样品筛( 浙江上虞市龙翔精密仪器厂) 。 乙二胺四乙酸( EDTA,标准品纯度≥99%,美 国 Sigma - aldrich) ;铜粒,氧化铜, VLT 催化剂, VHT 催化剂( 意大利 VELP 公司) ,五氧化二磷、锡箔纸 ( 均购自意大利 VELP 公司) ;硫酸,盐酸,硼酸,硫酸 铜,硫酸钾,氢氧化钠,甲基红,溴甲基酚绿,尿素 ( 分析纯,国药集团化学试剂有限公司) ; 氧气纯度 ≥99. 999%,氦气纯度≥99. 999%,氮气纯度≥ 99. 99%。

1. 3 样品处理 油菜籽、大豆、芝麻、菜粕等样品粉碎、过筛,然 后在105℃烘箱内干燥180min,样品上机检测。 1. 4 杜马斯燃烧法 测定步骤: 称取 100mg 样品( 总氮含量为 3 ~ 8mg) 于锡箔纸中压实,置于自动落样器上,待上机 检测。同上,称取 EDTA 标准品 15. 0、 20. 0、 30. 0、 40. 0、 50. 0、 60. 0、 70. 0、 80. 0、 100. 0 和 120. 0mg,待 上机检测,得标准曲线。样品燃烧反应条件:温度为1 200℃,氧气因子为 1. 8mL/mg,氧气流速为 400mL/min,氦气、氧气、氮气压力分别为 2. 0、 2. 5 和3. 0Pa,高温下充分燃烧分解,生成的气体被净 化、除杂,以氦气为载气传送,氮氧化物被还原后,混 合气体被吸附,分离,依次通过检测器( TCD) 检测, 标准曲线计算定量。样品粗蛋白含量计算公式: 粗 蛋白含量 = 总氮含量/样品质量 × 换算系数( 大豆 为 5. 71; 芝麻为 5. 30; 花生为 5. 46; 其他计为 6. 25 [8]) 。

1. 5 凯氏定氮法 称取0. 5 ~1. 0g 样品( 总氮含量5 ~80mg) 于消 化管中,加入催化剂( 6. 0g 硫酸钾, 0. 4g 硫酸铜) 和 12mL 硫酸, 420℃消化 120min 至消化液澄清,冷却 上机;定氮仪向消化管内加入 40mL 氢氧化钠溶液 ( 40%) 后蒸馏 5min,用盐酸标准溶液( 0. 1 mol/L) 滴定硼酸吸收液( 2%) ,溶液由蓝绿色变成灰红色 为滴定终点,由盐酸标准溶液消耗量计算样品粗蛋 白含量。 1. 6 统计分析 采用 SAS[9]统计软件对数据进行方差分析和多 重比较,并对相关系数和截距进行 t 检验, P < 0. 05 认为统计学检验有显著性差异。

2 结果与分析

2. 1 杜马斯燃烧法条件优化

2. 1. 1 称样量 采用油菜籽和大豆样品,发现称样 量对杜马斯燃烧法测定粗蛋白含量具有显著影响。 结果表明样品质量小于0. 10g 时,离散性大,样品均 匀度不够;大于0. 15g 时,燃烧不充分,测定结果偏 低;在 0. 10 ~ 0. 15g 时,变异系数小,结果稳定( 表 1) 。

2. 1. 2 样品粉碎细度 杜马斯燃烧法取样量小,样 品均一性影响粗蛋白测定结果准确性。表2 结果表 明20 目和 40 目样品筛处理的变异系数小。40 目 样品筛孔径小,样品处理时间长,效率低,所以20 目 样品筛适合对粉碎样品前处理。

2. 1. 3 氧气因子和氧气流量组合 采用油菜籽样 品,研究不同氧气因子和流量条件( 表3) 发现,组合1、 2、 3 中样品燃烧不充分,而组合4、 5、 6 中样品均燃烧充 分且检测结果无明显差异,因此宜采用氧气因子为1. 8mL/mg 和氧气流量400mL/min 的组合。

2. 1. 4 标准曲线 油料粗蛋白含量差异大,称取不 同质量 EDTA 标准品,以 EDTA 总氮含量为横坐标、 峰面积为纵坐标建立标准曲线。样品总氮含量为 1. 0 ~12. 0mg,标准曲线( 图 1) 为: y = 3 872. 7x –670. 32,线性相关系数为0. 999 1。

2. 2 杜马斯燃烧法测定油料中粗蛋白含量 采用优化后的杜马斯燃烧法测定5 种油料样品 粗蛋白含量,结果表明大豆中粗蛋白含量范围 33. 84% ~ 41. 31%,平均值 36. 89%; 花生为20. 41% ~ 27. 10%,平均值 24. 89%; 油菜籽为 18. 03% ~ 24. 81%,平 均 值 21. 57%; 芝 麻 为 19. 20% ~ 22. 47%,平均值 20. 07%; 菜粕为 38. 91% ~42. 86%,平均值40. 37%。 2. 3 杜马斯燃烧法和凯氏定氮法测定油料中粗蛋 白的比对研究 2. 3. 1 样品准确度实验及质量控制 采用 EDTA 和尿素标准样品,分别确定杜马斯燃烧法和凯氏定 氮法的准确度,两种方法回收率在 95. 4% ~ 100. 1%之间,准确度良好,符合油料作物中粗蛋白 含量分析的要求[10, 11] 。本实验室于 2009 ~ 2010 年 应加拿大谷物委员会邀请,参加了由世界33 个权威 质检机构组成的油料作物实验室能力验证项目 ( WCC/RCC Laboratory Proficiency Program) 。采用杜马斯燃烧法测定的油菜粗蛋白含量开展比对检 测。实验结果表明: 2009年样品CN2009CHK,本实验室测定值为 27. 81%, 33 个实验室平均值为 27. 96%,相对标准偏差为 - 0. 01%; 2010 年样品编 号 CN2010CHK 的,本实验室测定值为22. 54%, 33 个实验室平均值为 22. 66%,相对标准偏差为 -0. 01%。本实验室采用杜马斯燃烧法测定实验结 果与其他实验室一致,结果准确,重现性好。 2. 3. 2 杜马斯燃烧法和凯氏定氮法测定油料样品 中粗蛋白含量比较 表4 是杜马斯燃烧法和凯氏定 氮法分别检测大豆、花生、油菜籽、芝麻和菜粕样品 中粗蛋白含量。结果表明,样品两种方法测定值无 显著性差异( P >0. 05,C/K =0. 99 ~1. 02) ,杜马斯 燃烧法测定油料样品粗蛋白含量结果准确。 杜马斯燃烧法测定结果略高于凯氏定氮法( C/ K = 1. 00 ~1. 02) ,其中大豆、菜粕样品采用杜马斯 燃烧法和凯氏定氮法测定值间差值范围是 : -0. 52% ~0. 62%和 -0. 43% ~0. 79%。
2. 3. 3 相关性分析 图2 所示,杜马斯燃烧法和凯 氏定氮法测定值间呈显著线性相关( 相关系数为 0. 998 8, P < 0. 001) ,不存在显著差异( P > 0. 2) 。
因此,能够应用于油料粗蛋白含量检测。

2. 3. 4 杜马斯燃烧法在油料实际样品粗蛋白检测 中的应用 样品分别采用杜马斯燃烧法和凯氏定氮 法( 图3) ,平均变异系数分别为0. 34% 和 0. 43%, 其中大豆、花生、油菜籽、芝麻和菜粕等 5 种油料样 品杜马斯燃烧法测定值的平均变异系数分别为 0. 33%、 0. 40%、 0. 34%、 0. 34%、 0. 28%; 而凯氏定 氮法的平均为0. 44%、 0. 41%、 0. 46%、 0. 46%、 0. 35%。表明杜马斯燃烧法精密度好。

3 结论 杜马斯燃烧法测定5 种油料粗蛋白含量与凯氏 定氮法测定值显著线性相关,且杜马斯燃烧法测定 结果更稳定。采用杜马斯燃烧法参与国际实验室检 测比对能力验证,结果准确、重现性好,符合要求;其 前处理简单,时间短,成本低,能够自动连续大批量 检测,且避免造成环境污染,适用于油料实际样品粗 蛋白含量检测。

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