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测定饲料中蛋白质含量的比较研究

[导读]蛋白质含量是饲料质量控制的重要指标之一。本实验用凯氏定氮法和双缩脲法测定饲料中蛋白质含量作 对比实验, 结果表明: 这两种方法所得实验结果差异较大, 双缩脲法测得结果较凯氏法低约 15.1 %, 且结果不稳定, 不适于饲料蛋白质含量的测定。

饲料蛋白质含量的测定通常采用国标规定 的凯氏定氮法, 但用双缩脲比色法测定饲料中蛋 白质含量也有报道(陈革,2003)。本实验对多种饲 料样品采用双缩脲比色法进行蛋白质含量测定, 并将结果与凯氏定氮法进行对比和分析, 为实际 工作中选择合理的方法进行饲料中蛋白质含量的 测定提供科学依据。 

1 双缩脲法原理 当尿素加热至 150 ~160 ℃时, 可由两个分 子间脱去一个氨分子而生成二缩脲 ( 也叫双缩 脲)。其反应式如下: 2H2NCONH2→H2NCONHCONH2 +NH3↑双缩脲在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红 色的络合物, 此反应称为双缩脲反应。含有 2 个或 2 个以上肽键的化合物都具有双缩脲反应。由于 蛋白质分子中含有多个肽键(-CO-NH- ), 在碱性 溶液中与铜离子络合成紫红色络合物, 在一定条 件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比。据此可用 吸收光度法测蛋白质含量, 该络合物最大吸收波 长为 540 nm。

2 实验材料 

2.1 试剂 双缩脲试剂:称取 CuSO4·5H2O 1.5 g, 酒石酸钾钠(NaKC4O6·4H2O)6 g, 溶于 500 mL 蒸 馏水, 在搅拌下加入 300 mL 质量分数 10 % NaOH 溶液, 然后用蒸馏水稀释到 1000 mL。配好 后贮于塑料瓶中。 蛋白质标准溶液(7 g/100mL), 由河北保定长 城试剂有限公司提供。 10 %氢氧化钾溶液: 称取分析纯氢氧化钾 50g溶于 500 mL蒸馏水中。 

2.2 主要仪器 粉碎机; 分样筛: 孔径 0.45 mm (40 目);751 紫外/可见分光光度计; 电热恒温水 浴锅; 分析天平: 感量 0.0001 g; 电炉; 玻璃烧杯; 具塞玻璃试管:25 mL; 容量瓶; 托盘天平等。 3 测定方法 3.1 标准曲线绘制 将蛋白质标准液(7 g/dL)用 0.1 mol/L NaOH 溶液稀释至 4 mg/mL。分别取蛋 白质标准液(4 mg/mL)0.0、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5mL 于 25 mL具塞比色试管中, 用蒸馏水补齐至 1.0 mL, 然后各比色管中加入 4.0 mL 双缩脲试剂, 混 匀, (37± 0.2) ℃保温 30 min。以空白管调零, 用751 型分光光度计在 540 nm 波长, 杯径 1 cm, 测 定吸光值。以蛋白质含量(mg/mL)为横坐标, 以吸 光值为纵坐标作标准曲线, 如图 1 所示

3.2 饲料中蛋白质的测定 

3.2.1 样品来源 饲料市场采集的具代表性饲料 样品 10 个。 

3.2.2 样品处理 将样品粉碎后经 40 目筛过 滤, 准确称取 0.2 g(精确至 0.0002 g)饲料样品于 具塞试管中, 加入 10 % KOH 溶液 10 mL, 沸水浴 30 min, 冷却后用蒸馏水定容至 25 mL, 过滤。取 饲料过滤液 0.5 mL, 以蒸馏水补齐至 1.0 mL, 加 4.0 mL双缩脲试剂, (37± 0.2) ℃反应 30 min。以 空白管调零, 在 540 nm 处测定吸光值, 依据标准 曲线, 求得浓度值。计算公式如下: 饲料样品蛋白质含量(%)=C× 2× 25/W× 1000。 式中,C 为经标准曲线求得的浓度值(mg/ mL);W为饲料样品重量(g)。 

4 结果与分析 

4.1 不同饲料样品的对比实验结果 见表 1。从 表 1 可以看出, 双缩脲法对饲料蛋白质含量的测 定结果与凯氏定氮法测定结果, 相差较大, 比凯氏 定氮法所测值低 15.1 %(5.8 % ~31.7 %)。孙建 平和侯彩云(2005)认为双缩脲法的测定结果比凯 氏法小 10 % ~20 %。凯氏定氮法测得的蛋白质 含量是粗蛋白质, 即含氮量乘以 6.25, 其中包括无 机氮和氨基酸。双缩脲法测得的蛋白质含量是真 蛋白质。是碱溶液所能溶解的蛋白质, 并且与双缩 脲反应转为络合物的显色部分; 而不溶解的那一 部分蛋白质和双缩脲试剂的反应很少, 即使有反 应, 产生的有色络合物经过滤并不存在于最终的 比色液中。因此, 比色测定中读出的吸光度值, 只 是可溶蛋白质形成的有色络合物的吸光度值。另 外, 饲料中添加的蛋白质原料较为复杂, 有豆粕、花生粕、棉籽饼、菜籽饼、鱼粉、羽毛粉等。测定中 虽经过粉碎、过筛、碱液煮沸, 但有些蛋白质仍难 溶于测试液中, 与真实值相比产生较大误差。并且 饲料中含有大量的粗纤维, 对于粗纤维含量较高 的样品, 双缩脲法测定结果不十分稳定 (王敏, 2003)。

4.2 在牛奶、豆浆、牛血清中的对比实验 结果 见表 2。从表 2 可以看出, 利用双缩脲法测定牛 奶、豆汁、牛血清蛋白质含量与凯氏法测定结果较 为接近, 因为这些样品中所含蛋白质溶解度较高, 所含蛋白质种类相对较少, 其性质与标准蛋白液 接近。

4.3 双缩脲法测定饲料蛋白质含量精密度实验 对 5 号、 6 号饲料样, 分别取 6 个样品用双缩脲法 测定蛋白质含量, 结果见表 3。从表 3 可以看出, 双缩脲法对同一饲料样品的平行测定结果, 重现 性较好, 精密度较高。符合国标规定蛋白质测定 结果的相对偏差范围, 但平均值与凯氏法结果差 距较大。 

5 小结 双缩脲法测定饲料蛋白质虽然不经消化, 不 产生有害气体, 但并不省时。饲料中淀粉经碱溶液 及加热处理而糊化, 难以过滤, 尤其配合料淀粉含量高,2 h 只能过滤 1 ~2 mL(浓缩料相对较快), 且此法受工作环境(温度等)影响较大, 若每次作 标准曲线就更费时。饲料中成分复杂, 某些离子 对显色反应会产生影响, 这也是结果不稳定的原 因。 综上所述, 双缩脲法不适于配合饲料和浓缩 饲料蛋白质含量的测定。



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