KDN-103A  HYP-308消化炉 上海纤检仪器有限公司
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上海纤检微量凯氏定氮法测定蛋白质含量

[导读]以经典的微量凯氏定氮法为基础,对消化装置进行了一定的研究和改进,使消化时间大大缩短;并针对混合 指示剂必须现用现配且滴定终点不易判断的不足,选用酸度计代替混合指示剂判断滴定的终点,使测定结果的准确度提高。实验表明,改良后的蛋白质含量测定方法不仅操作简便,而且污染减少,结果更加准确。

凯氏定氮法测定蛋白质含量具有一定的准确度,在物质蛋白含量的测定中运用比较广泛。但凯氏定氮法也存在着一些不足之处,如消化时间长、环境污染大、滴定终点不易控制等。鉴于此,本研究在传统凯氏定氮法的基础上,对试验装置和操作方法进行了一些改进,从而提高了测定蛋白质的效率,并且降低了测定过程中对空气的污染。

1 试验材料与方法

1.1 试验仪器及试剂

1.1.1 仪器

上海纤检凯氏定氮仪、微量滴定管、容量瓶 (100 mL)、锥形瓶 (100 mL、250 mL) 消化炉、漏斗 、玻璃弯管、通风橱、酸度计、电炉。

1.1.2 试剂

绿豆粉、浓度为 0.01 mol/L 盐酸标准溶液、浓硫酸、体积分数 1%硼酸吸收液、质量分数 10%硫酸铜溶液、硫酸钾、质量分数 25%氢氧化钠溶液、甲基红一次甲基蓝混合指示剂、30%过氧化氢、稀碱溶液、硫酸铵、草酸铵。

1.2 实验步骤

1.2.1 消化装置的组装

将原微量凯氏定氮法需要固定的凯氏烧瓶换成不需要固定的 250 mL 的锥形瓶[1],同时在瓶口倒置一漏斗,漏斗颈顶部用玻璃弯管连接,弯管再用导管与内盛稀碱溶液的大烧杯相连。

1.2.2 消化

称取均匀样品 0.2~0.3 g,放入干燥的 250 mL 的锥形瓶中,再加入质量分数 10%的硫酸铜 5 mL 和0.30 g 硫酸钾及 8.00 mL 浓硫酸,同时做空白对照实验,摇匀后将烧瓶放在垫有铁丝网的电炉上,在瓶口倒置一漏斗,漏斗颈顶部用玻璃弯管连接,弯管再用导管与内盛稀碱溶液的大烧杯相连。装置安装好后,放在通风橱中,打开电炉,对烧瓶直接加热,进行消化。起初用小火并随时调节火的大小,使产生的烟气被碱液完全吸收;待内容物全部炭化,泡沫完全停止后加强火力,随时转动烧瓶,使瓶壁上的内容物全部回流入消化液中,烧至溶液透明,沉淀灰白,取下待冷。将 10 mL 蒸馏水沿瓶壁加入锥形瓶内,转入 100mL 容量瓶内,以蒸馏水冲洗数次,洗液合并入容量瓶中,待冷却后稀释至刻度,备用。

1.2.3 测定

煮沸蒸馏水 (蒸馏水发生瓶中)。在 100 mL 锥形瓶内加入 15 mL 体积分数为 1%硼酸吸收液,置于冷凝器下,并使管口浸入硼酸内,夹紧放气口,取10 mL 样品稀释液或空白液由进样口注入反应室。以5 mL 蒸馏水冲洗样口,用量筒量取 5 mL 质量分数25%NaOH,迅速倒入进样口,并立即塞好,加水于进样口,以防氨逸出,从第 1 滴溜液滴下开始计时,蒸馏 3 min,移动吸收瓶,使硼酸液面离开冷凝管口,再蒸馏 1 min,然后用少量蒸馏水冲洗冷凝管下端,从而保证了游离氨被完全蒸馏接收。氨是否完全蒸馏出来,可用 pH 试纸试验馏出液是否为碱性而确定。取下吸收瓶,用酸度计滴定至 pH 值 5.1 (取混合指示剂变色点均值),记下消耗酸的体积 (mL)。继续夹紧排气口,提起进口塞,使蒸馏水流入反应室,捏紧进气橡皮管,以断绝蒸汽源。这时反应室中的废液被自动吸出,如此反复冲洗干净反应室,将排气阀打开,使反应室外层中的废液排出。

1.3 改进前后滴定结果的准确度和精密度测定测定方法见文献[2]。

1.4 回收率测定

回收率测定方法见文献[3]。

2 计算

蛋白质含量 =(V2- V1)×0.01×0.014×转换系数

V3×m ×100%.

式中:V2——滴定样液消耗 HCl 的体积,mL;

V1——滴定空白液消耗 HCl 的体积,mL;

V3——蒸馏时吸取稀释液体积,mL;

0.01——HCl 的浓度,mol/L;

m——样品质量,g;

0.014——0.01 mol/L 盐酸标准液 1 mL 相当氮的量,g。

3 结果与分析

3.1 蛋白质含量测定结果对比

分别采用改进前、后的凯氏定氮法,测定 3 组绿豆粉平行试样中的蛋白质含量。

凯氏定氮法改进前后蛋白质含量测定结果的对比凯氏定氮法改良前后的蛋白质含量测定结果基本一致,但改进后的标准差和变异系数变小,说明改进后的测定方法具有更高的精密度

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凯氏定氮法测定蛋白质含量具有一定的准确度,在物质蛋白含量的测定中运用比较广泛。但凯氏定氮法也存在着一些不足之处,如消化时间长、环境污染大、滴定终点不易控制等。鉴于此,本研究在传统凯氏定氮法的基础上,对试验装置和操作方法进行了一些改进,从而提高了测定蛋白质的效率,并且降低了测定过程中对空气的污染。

1 试验材料与方法

1.1 试验仪器及试剂

1.1.1 仪器

上海纤检凯氏定氮仪、微量滴定管、容量瓶 (100 mL)、锥形瓶 (100 mL、250 mL) 消化炉、漏斗 、玻璃弯管、通风橱、酸度计、电炉。

1.1.2 试剂

绿豆粉、浓度为 0.01 mol/L 盐酸标准溶液、浓硫酸、体积分数 1%硼酸吸收液、质量分数 10%硫酸铜溶液、硫酸钾、质量分数 25%氢氧化钠溶液、甲基红一次甲基蓝混合指示剂、30%过氧化氢、稀碱溶液、硫酸铵、草酸铵。

1.2 实验步骤

1.2.1 消化装置的组装

将原微量凯氏定氮法需要固定的凯氏烧瓶换成不需要固定的 250 mL 的锥形瓶[1],同时在瓶口倒置一漏斗,漏斗颈顶部用玻璃弯管连接,弯管再用导管与内盛稀碱溶液的大烧杯相连。

1.2.2 消化

称取均匀样品 0.2~0.3 g,放入干燥的 250 mL 的锥形瓶中,再加入质量分数 10%的硫酸铜 5 mL 和0.30 g 硫酸钾及 8.00 mL 浓硫酸,同时做空白对照实验,摇匀后将烧瓶放在垫有铁丝网的电炉上,在瓶口倒置一漏斗,漏斗颈顶部用玻璃弯管连接,弯管再用导管与内盛稀碱溶液的大烧杯相连。装置安装好后,放在通风橱中,打开电炉,对烧瓶直接加热,进行消化。起初用小火并随时调节火的大小,使产生的烟气被碱液完全吸收;待内容物全部炭化,泡沫完全停止后加强火力,随时转动烧瓶,使瓶壁上的内容物全部回流入消化液中,烧至溶液透明,沉淀灰白,取下待冷。将 10 mL 蒸馏水沿瓶壁加入锥形瓶内,转入 100mL 容量瓶内,以蒸馏水冲洗数次,洗液合并入容量瓶中,待冷却后稀释至刻度,备用。

1.2.3 测定

煮沸蒸馏水 (蒸馏水发生瓶中)。在 100 mL 锥形瓶内加入 15 mL 体积分数为 1%硼酸吸收液,置于冷凝器下,并使管口浸入硼酸内,夹紧放气口,取10 mL 样品稀释液或空白液由进样口注入反应室。以5 mL 蒸馏水冲洗样口,用量筒量取 5 mL 质量分数25%NaOH,迅速倒入进样口,并立即塞好,加水于进样口,以防氨逸出,从第 1 滴溜液滴下开始计时,蒸馏 3 min,移动吸收瓶,使硼酸液面离开冷凝管口,再蒸馏 1 min,然后用少量蒸馏水冲洗冷凝管下端,从而保证了游离氨被完全蒸馏接收。氨是否完全蒸馏出来,可用 pH 试纸试验馏出液是否为碱性而确定。取下吸收瓶,用酸度计滴定至 pH 值 5.1 (取混合指示剂变色点均值),记下消耗酸的体积 (mL)。继续夹紧排气口,提起进口塞,使蒸馏水流入反应室,捏紧进气橡皮管,以断绝蒸汽源。这时反应室中的废液被自动吸出,如此反复冲洗干净反应室,将排气阀打开,使反应室外层中的废液排出。

1.3 改进前后滴定结果的准确度和精密度测定测定方法见文献[2]。

1.4 回收率测定

回收率测定方法见文献[3]。

2 计算

蛋白质含量 =(V2- V1)×0.01×0.014×转换系数

V3×m ×100%.

式中:V2——滴定样液消耗 HCl 的体积,mL;

V1——滴定空白液消耗 HCl 的体积,mL;

V3——蒸馏时吸取稀释液体积,mL;

0.01——HCl 的浓度,mol/L;

m——样品质量,g;

0.014——0.01 mol/L 盐酸标准液 1 mL 相当氮的量,g。

3 结果与分析

3.1 蛋白质含量测定结果对比

分别采用改进前、后的凯氏定氮法,测定 3 组绿豆粉平行试样中的蛋白质含量。

凯氏定氮法改进前后蛋白质含量测定结果的对比凯氏定氮法改良前后的蛋白质含量测定结果基本一致,但改进后的标准差和变异系数变小,说明改进后的测定方法具有更高的精密度

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