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尿素 、氯化铵 、碳酸铵对牛奶样品微量凯氏定氮法的干扰

[导读]用微量凯氏定氮法测定未加含氮干扰物质的牛奶蛋白含量, 再用微量凯氏定氮法测定加尿素、氯化铵、碳酸铵的牛奶蛋白含量, 然后对添加含氮干扰物质前后牛奶蛋白含量进行比较

 凯氏定氮法的普遍适用性 、精确性和可重复性已经得到了国际的广泛认可[ 1] .它已经被确定为检测食品中蛋白质含量的标准方法[ 2] .目前, 牛奶中蛋白含量的测定主要采用国标法凯氏定氮法[ 3], 该方法基于测定含氮量来间接测定蛋白质含量,它与所测样品的蛋白质组成无关,不受样品颜色的影响 ,是美国食品药品监督局 (FDA)推荐的测定蛋白的方法

[ 4] .但是, 这种方法并不能给出真实的蛋白质含量, 因为凯氏定氮法所测定的氮可能不仅仅是由蛋白质转化来的 ,它也可以是其他非蛋白质物质所转化的[ 5], 因此有些人便利用凯氏定氮法这一缺陷往牛奶中加入各种非蛋白氮来干扰凯氏定氮法测定牛奶蛋白含量 ,达到以假乱真以次充好的目的 .近年来, 国内外多次发生牛奶掺假事件 .特别是 2008年我国发生了国产奶粉中大规模地检测出三聚氰铵的毒奶粉事件, 这一以非蛋白 (三聚氰铵)充当蛋白的掺假行为使人们的健康受到严重影响 ,也显现出了传统的牛奶蛋白定量检测方法 (凯氏定氮法 )的种种缺陷和不足.为了进一步探索非蛋白氮对凯氏定氮法的影响程度 ,本实验特意对尿素 、氯化铵、碳酸铵 3种含氮物质对凯氏定氮法测定牛奶蛋白含量的干扰

进行专门的研究和探讨.目前 ,国内外对凯氏定氮法的研究比较多,对凯氏定氮法测定食物蛋白时的干扰因素也比较关注

[ 6-10],但大多集中在通过改良凯氏定氮法[ 11-13] 和用其他蛋白质测定方法代替凯氏定氮法从而避免干扰物质对凯氏定氮法的影响这两方面 .例如主张用红外技术[ 14]代替凯氏定氮法或用三氯乙酸[ 15] 处理样品 ,让真正的蛋白质形成沉淀,过滤后 ,分别测定沉淀和滤液中的氮含量 ,从而测定蛋白质的真正含量和冒充蛋白质的氮含量 .而事实上对凯氏定氮法测定食物蛋白时的干扰因素的深入研究很少 ,目前尚未见到针对尿素 、氯化铵 、碳酸铵等含氮物质在凯氏定氮法测定牛奶蛋白含量时的干扰程度,在本实验之前, 非蛋白质含氮物质已被确认为凯氏定氮法测定食物蛋白含量的干扰因素, 因此本文的研究着重探讨尿素 、氯化铵、碳酸铵含氮物质对凯氏定氮法测定牛奶蛋白含量具有明显的干扰作用及干扰作用的强度.

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

紫外分光光度计 :2 100 pro型 (北京瑞利分析仪器公司 )、微量凯氏定氮仪 .

所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制.硫酸铜 、硫酸钾 、硫酸、40 g/L硼酸吸收液 (20 g硼酸溶解于 500mL热蒸馏水中)、过氧化氢溶液(体积分数为 30% ),氢氧化钠溶液(质量比为 400/1 000;称取 400 g氢氧化钠 ,用 1 000 mL水溶解,待冷却后移入试剂瓶中)、甲基红一漠甲酚绿混合指示剂 (用体积分数为 95%的乙醇将澳甲酚绿及甲基红分别配成 1 g/L的乙醇溶液, 使用时按 1 g/L澳甲酚绿与 1 g/L甲基红的体积比为 5∶1的比例混合)、0.1 mo1/L硫酸 (或盐酸 )标准溶液 .

牛奶样品溶液:来源当地超市的伊利 250 mL纯牛奶 (批号 :D10209E1203)

1.2 实验方法

1.2.1 牛奶稀释样品及尿素等干扰样品的配制 取 0.1 mL牛奶原品,用二次蒸馏水定容到 5 mL,得 50倍稀释样品,从 5 mL的 50倍稀释样品中取 2.5 mL再次定容到 5 mL, 得 100倍稀释样品 .从 100倍牛奶稀释样品中各取 0.1 mL于 6管试管中 ,分别加入干扰品(尿素或氯化铵或碳酸铵 )配制成 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0 mol的干扰品 .

1.2.2 牛奶稀释样品中蛋白浓度的测定 用微量凯氏定氮仪测定 50倍、100倍牛奶稀释样品中的蛋白含量 ,分别取 1 mL的 50倍、100倍牛奶稀释样品于 8管消化管中 ,蒸发至干.然后依次向各消化管中加入硫酸铜与硫酸钾 (体积比为 4∶100)的混合 200 mg、硫酸 5 mL及数粒玻璃珠至于电炉上缓慢加热消化, 注意防止溶液沸腾.再将消化液用定氮仪蒸馏 ,蒸馏步骤为:在各消化液中加入适量的 30%NaOH溶液开始蒸馏(用蒸馏水做空白液), 反应出来的氨用硼酸溶液吸收 ,蒸馏液用 0.01 mol/L的盐酸滴定 (采用微量滴定管 ),计算出含氮量.将含氮量乘以 6.25换算成蛋白质的含量 .

1.2.3 牛奶干扰样品中蛋白浓度的测定 方法同牛奶稀释样品中蛋白浓度的测定 .分别测定加入不同种类和浓度干扰物后 (尿素 /氯化铵 /碳酸铵), 50倍、100倍稀释牛奶的蛋白浓度.

1.2.4 微量凯氏定氮法的测定步骤 分别取 1 mL的 50倍 、100倍牛奶稀释样品和不同尿素浓度的干扰样品于 8管消化管中,蒸发至干 .然后依次向各消化管中加入硫酸铜与硫酸钾 (体积比为 4∶100)的混合物 200mg、硫酸 5 mL及数粒玻璃珠置于电炉上缓慢加热消化,注意防止溶液沸腾.再将消化液用定氮仪蒸馏 ,蒸馏步骤为 :在各消化液中加入适量的 30%NaOH溶液开始蒸馏 (用蒸馏水做空白液 ), 反应出来的氨用硼酸溶液吸收 ,蒸馏液用 0.01 mol/L的盐酸滴定 (采用微量滴定管),计算出含氮量.将含氮量乘以 6.25换算成蛋白质的含量

讨论

微量凯氏定氮法的精确性和可重复性已经得到了国际的普遍认可 ,被广泛用于检测食品中蛋白质含量.本试验首先使用凯氏定氮法分别测定牛奶样品的不同浓度稀释品中的蛋白浓度, 表 1 的结果显示 50倍和100倍稀释样品中蛋白质浓度的变异系数分别为 0.91%、1.02%,表明微量凯氏定氮法在测定牛奶样品中的蛋白含量稳定性好.在测定加入不同干扰物(尿素 /氯化铵 /碳酸铵 )的 50倍、100倍稀释牛奶的蛋白含量时,由表 2、表 3、表 4结果显示其相对平均偏差均大于 1%, 相对标准偏差均大于 2%, 表明微量凯氏定氮法在测定加入不同干扰物的 50倍、100倍稀释牛奶的蛋白含量时, 重现性差, 精密度也差 ,并且所测定的加入干扰物质的 100倍稀释比 50倍稀释牛奶牛奶的蛋白含量的准确性要差, 这可能是因为相同量的干扰物质对相对稀释牛奶样品的蛋白含量影响更明显 ,因为相同量的干扰物质在相对稀释牛奶样品中相对较多 ,所占的分量较大.另外, 凯式定氮法得到的尿素干扰牛奶样品中蛋白含量最高且误差最大的这一现象 ,这可能和加入牛奶样品中的不同干扰物的含氮量相关 ,尿素的含氮量为 46.7%, 碳酸铵含氮量为 29.2%, 氯化铵含氮量为26.2%, 尿素中含量相对较高的非蛋白氮对微量凯氏定氮法的干扰也最明显, 以至在加入稀释牛奶样品的 3种干扰物中 ,加入尿素的一组相对误差最大.本实验在加入稀释牛奶样品的同一种干扰物中 ,随着加入的干扰物的量逐渐增加,干扰物对微量凯氏定氮法测定牛奶蛋白含量的干扰越明显, 产生的相对误差也逐渐增大 .例如在表 5中 ,随着加入尿素干扰物的量逐渐增加,两种不同稀释度样品的相对误差分别从 1.86%增加到 14.46%, 从 4.16%增加到 32.05%.总之,干扰物质中的非蛋白氮对微量凯氏定氮法测定牛奶蛋白含量有干扰, 非蛋白氮含量越多, 干扰越明显 .

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