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凯氏定氮法与杜马斯燃烧法测定大豆粗蛋白的比较研究

[导读]在本试验中所选定的样品范围内,作为测定饲料原料粗蛋白含量的方法,两种方法可以相互替代,其中杜马斯燃烧法的稳定性优于凯式定氮法;至于 2 种方法的准确性比较需要进一步的研究。

大豆是一种富含蛋白质的豆科植物,目前广泛用于畜禽饲料生产,因此,准确测定饲料原料粗蛋白含量对于合理配制动物饲料有重要作用,也是研究动物营养的重要内容之一。目前,最常用的定氮方法是 Kjeldahl 于 1883 年提出的凯氏定氮法,但该方法测定时间长,且需要使用危险试剂,易造成环境的污染和人员的安全隐患。因而,随着设备的不断改进,杜马斯燃烧法又逐渐代替传统的凯氏定氮法。

1833 年,Jean Baptiste Dumas 就开发出燃烧定氮法[1],但由于早期的杜马斯法只能检测几个微克的样品,故其实际应用受到了极大的限制。如今,杜马斯燃烧法测定设备先进,操作简单、方便,其封闭的反应体系对环境不造成污染,并可以在很大程度上消除人工造成的误差,因而应用范围较为广泛。

虽然目前测定蛋白含量的方法很多,但凯氏定氮法和杜马斯燃烧法最为常用。测定婴儿食品[2]、动物饲料[3,4]、鱼粉[5]、奶制品[6]等产品中的蛋白时,常常用到凯氏定氮法和杜马斯燃烧法。2 种方法均能较为准确的测定样品中的含氮量,农业部也分别有相应的检测标准。但问题也随之而来,对同一物质的蛋白含量测定,两种方法的检测结果不可避免的会存在差异,究竟哪一种更为准确和稳定?所以,迫切需要对两种检测方法的优劣进行评估[7]。理论上而言,由于杜马斯燃烧法能够测定出凯氏定氮法不能测定的硝态氮等含氮物质,因此一般杜马斯燃烧法的测定值略大于凯氏定氮法。本实验通过对来自中国不同地区的 162 种大豆样品的检测,分别应用凯氏定氮法和杜马斯燃烧法来测定粗蛋白含量,并通过统计分析进行 2 种方法的比较。

1 材料与方法

1.1 材料来源与前处理 162 种来自中国不同地区的种植大豆样本各 100 g,由农科院作物科学研究所惠赠;所有样品均在 110℃烘箱内干燥 4 h,用 40 目筛片式粉碎机粉碎,并置于塑料袋中。分别用凯氏定氮法和杜马斯燃烧法测定样品的粗蛋白含量。

1.2 凯氏定氮法 取 0.3 g 左右大豆样品于消化管中,加入催化剂(高效凯氏定氮催化剂片,北京金元兴科科技有限公司)2 片、浓硫酸 15 mL,在 420℃下消化 1~1.5 h,至消化液澄清为止。用半自动定氮仪(Kjeltec TM 2100,FOSS,Danmark)蒸馏 5 min,用标准盐酸溶液滴定硼酸吸收液。计算大豆粗蛋白含量[8]。

1.3 杜马斯燃烧法 采用德国 Elementar 大进样量元素分析仪 (Vario MACRO, elementar, Germany),称取 100 mg 大豆样品于锡箔纸中,压实,置于自动落样器上。样品落入燃烧反应炉,在 800~1 200℃的高温下燃烧分解,生成的气体随后被净化,除杂;燃烧生成的气体用氦气作载气传送;在氮氧化物被还原后,混合气体被吸附;根据不同的组分分离,并分别依次通过检测器(TCD)检测;随后,根据样品的重量和存储的校正曲线形成的检测信号,仪器给出元素的百分比含量值。计算机自动输出结果。由于大豆的粗蛋白系数是 5.71,因此 2 种方法检测出的氮含量分别乘以系数 5.71,得出粗蛋白含量[9]。

1.4 统计分析 利用 SAS[10]统计软件进行统计描述和配对 t 检验。P < 0.05 认为统计学检验有显著性差异。

2 结 果

2.1 2 种方法对大豆样品检测的基本结果 由表 1可知,不同测定方法得出的粗蛋白含量有差异,但样本大豆的粗蛋白含量平均在 37%左右,最高含量可达 49%以上。其中,SaiKai 大豆粗蛋白含量用 2 种方法测定值均为最高,说明 SaiKai 是样本中粗蛋白含量最高的大豆;而由 2 种方法测定的最低值不一致,凯氏法测得铁丰 18 粗蛋白含量最低,杜马斯法测得红丰 11 号大豆粗蛋白含量最低,测定方法的差异、样品的因素、试剂因素、操作人员的误差等都可能导致结果的差异。

2.2 2 种检测方法结果的相关性分析 在对样品

检测值的统计描述基础上,本研究对 2 种检测方法的相关性进行分析。图 1 所示,两种测定方法测定值之间存在显著线性相关 (r = 0.9789),拟合直线与Y=X 不存在显著差异(P = 0.21 > 0.05)。因此,凯氏定氮法和杜马斯燃烧法可以相互替代测定大豆粗蛋白含量。

2.3 2 种方法检测结果的准确性和稳定性比较

为进一步比较 2 种检测方法检测结果的稳定性,以其中 10 种大豆为代表,分别用凯氏定氮法和杜马斯燃烧法测定大豆粗蛋白含量的具体结果见表 2。利用凯氏定氮法测定大豆中粗蛋白含量时,50%左右的平行样之间相差在允许范围之内。凯氏定氮法存在诸多的误差来源,试剂的量取、实验人员操作误差等都会导致实验结果的不稳定性。而由杜马斯燃烧法测定的大豆粗蛋白含量结果显示,平行大豆样品测定相差都在误差允许范围之内,其相对误差均在 0.4%以下,因而可直接测定单样品,这样则减轻了测定大量样品实验的负担。杜马斯燃烧法的变异系数也远小于凯氏定氮法的变异系数,所以,燃烧法的测定结果比凯氏法更为稳定。而且,虽然在测定大部分种类的大豆粗蛋白时,2 种测定方法没有显著性差异 (P > 0.05,D/K=0.98~1.02),但 Clark、Fayette、Williams 大豆测定结果中存在显著性差异(P < 0.05),且杜马斯燃烧法的测定值比凯氏定氮法的要高(D/K=1.00~1.02)。根据 Watson等[11]报道,可能是大豆中存在的硝态氮导致差异的出现。硝态氮是导致燃烧法测定值高于凯氏定氮法测定值的原因之一,但不是唯一原因[7]。可见,不能因为杜马斯燃烧法的测定值普遍略高于凯式定氮法,就认为前者明显优于后者。

3 讨 论

凯氏定氮法是利用硫酸及催化剂与样品加热消化,使蛋白质分解,其中 C、H 形成 CO2 和 H2O 逸出,而蛋白质中的 N 则转化成(NH4)2SO4,在强碱条件下加热蒸馏,其中 NH3 被硼酸吸收为(NH4)2B4O7,然后用标准的盐酸溶液滴定,根据盐酸的消耗量和浓度计算出氮的含量,再乘以蛋白质系数 6.25,即为蛋白质含量。因而可知,凯氏定氮法测定样品粗蛋白时使用了硫酸、强碱、盐酸等危险性试剂,容易对操作人员和环境等造成潜在危害;实验过程中逸出的CO2、少量的 NH3 等气体不仅会危害操作人员健康,也会造成环境污染;而且每个样品需要 5 min 左右测定,在测定大样本实验中需花费很多时间和人力;不仅如此,该方法在很大程度上受到检测人员的影响,存在较大的随机误差。

本实验的杜马斯燃烧法采用德国 Elementar 大进样量元素分析仪进行检测。样品在 800~1 200℃的高温下燃烧分解,生成的气体被净化后,用氦气作载气体传送,混合气体被吸附 / 脱附柱根据不同的组分进行分离,并依次通过检测器检测,随后,根据样品的重量和已存储的校正曲线形成检测信号,仪器自动给出元素的百分比含量。使用该法测定氮元素含量的测量精度高,测定时只需 100 mg 左右样品即可,并且可以测定凯氏定氮法不能测出的硝态氮等氮元素,因而可以很准确地反映样本的含氮量;杜马斯燃烧法整个过程在仪器内部完成,不会对环境造成污染,同时具有自动加样功能,可节省人力和时间;但杜马斯燃烧法所用仪器成本高,维修繁琐,故其送检样品检测成本相对较高,一般应用范围不广。从 2 种不同粗蛋白测定方法的检测结果得出,本实验测定的 162 种大豆样品粗蛋白含量在 37%左右,超过了进出口贸易中大豆粗蛋白最低值 34.5%。其中,27%左右的大豆样品粗蛋白含量在 34.5%以下,最低为 27.27%(由凯氏定氮法测得)。而进出口贸易中,美国大豆粗蛋白均值为 35.7%,其最低值一般是34.0%,由此可见,中国大豆粗蛋白含量有待提高,不仅是测定方法的准确性,更重要的是新品种开发技术。

在本实验检测结果显示,杜马斯燃烧法测定大豆粗蛋白与凯氏定氮法没有显著性差异,可以相互替代。但是,杜马斯燃烧法测定值的稳定性比凯氏定氮法强,操作简单,能够在更短的时间内测定大量样品蛋白含量,并且能够不造成环境污染和避免操作人员的危险,因此,杜马斯燃烧法可以作为常规蛋白分析的优选方法。

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