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双缩脲法和凯氏定氮法测定牛乳中酪蛋白质量分数的比较

[导读]双缩脲法测得的酪蛋白质量分数比凯氏定氮法的结果高约 8.89%,但比纯品酪蛋白干 基换算的结果低约 6.37%,所得纯品酪蛋白的蛋白质含量约为 86%。

酪蛋白是牛乳中的特征性组分,约占牛乳中 总蛋白质含量的 80%,且其含量一般很少受季节、 饲料等影响,对于同一品种的奶牛,其含量相对 比较恒定[1]。酪蛋白质量分数的定义为:牛乳中酪 蛋白的含量占牛乳中总蛋白质含量的百分比。在乳制品加工中,一般造假牛乳所使用的蛋白胶或 水解动植物蛋白等廉价含氮物质,虽能提高牛乳 的总含氮量,但不能增加酪蛋白含量,所以通过 检测酪蛋白质量分数可以间接鉴别出掺假牛乳。 本实验在等电点沉淀法分离牛乳酪蛋白的基础上,采用双缩脲法和凯氏定氮法分别直接测定 牛乳中的酪蛋白质量分数,并通过洗涤、干燥等 步骤制得牛乳中纯品酪蛋白干物质,并用凯氏定 氮法对纯品酪蛋白的蛋白质含量进行了测定,为 实际工作中选择合理的方法测定牛乳中酪蛋白质 量分数提供了科学依据。

1 检测原理
1.1 等电点沉淀法检测原理 牛乳蛋白质主要分为酪蛋白和乳清蛋白两大 类,通常的定义是:在 pH 值为 4.6 时从牛乳中沉 淀的蛋白质称为酪蛋白;在同样条件下不沉淀的 称为乳清蛋白[2]。正常牛乳的 pH 值为 6.6~6.8,在 牛乳中加入酸,当达到其等电点时,采用离心分 离的方法,酪蛋白以及夹杂物就会以沉淀的形式 析出。通过对沉淀物用蒸馏水、乙醇-乙醚等体 积混合液、乙醚 3 种洗涤剂洗涤提纯,最后采用 102 ℃直接干燥沉淀物至恒重,即得纯品酪蛋白干 物质。

1.2 双缩脲检测法原理 双缩脲(NH3CONHCONH3)是两分子的脲经 180 ℃加热,放出一分子氨后得到的产物。在强碱性溶 液中,双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物,成为双 缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的 肽键,或间隔一个碳原子相连的肽键结构的化合 物都可以发生双缩脲反应[3]。由于蛋白质分子中含 有多个肽键,在碱性溶液中与铜离子络合成紫红 色络合物,在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含 量成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸组成无关, 该络合物在 540 nm 处有最大吸收峰[4]。据此可用吸 收光度法测定蛋白质含量。

1.3 凯氏定氮法检测原理 蛋白质为含氮有机物,样品与浓硫酸和硫酸 铜、硫酸钾一起加热消化,使蛋白质分解,其中 碳和氢被氧化成二氧化碳和水逸出,样品中有机 氮转化成氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏, 使氨游离,用硼酸吸收后,用标准盐酸或硫酸溶 液滴定。根据标准酸的消耗量计算出蛋白质含量。

2 实验材料
2.1 试剂 等电点沉淀法主要试剂:10%乙酸溶液、无水 乙醇、无水乙醚、混合指示剂。 双缩脲法主要试剂:称取 CuSO4·5H2O 0.75 g,酒石酸钾钠(NaKC4H4O6·4H2O)3 g,溶于 250 mL 蒸 馏水,边搅拌边加入 150 mL、10%NaOH 溶液, 然后用水稀释至 500 mL,配好后贮于塑料瓶中。 酪蛋白标准溶液:准确称取 1.0000 g 酪蛋白, 美国 Sigma 公司,纯度 99.99%,以 0.1 mol/L NaOH 溶液溶解,后定容到 100 mL,配成 10 mg/ mL 标准溶液备用。 10%NaOH 溶液:称取分析纯氢氧化钠 50 g 溶 于 500 mL 蒸馏水中。 凯氏定氮法主要试剂:硫酸铜、硫酸钾、浓 硫酸、40%氢氧化钠溶液、4%硼酸溶液、0.1 mol/ L 盐酸溶液、混合指示剂。

2.2 主要仪器 等电点沉淀法主要仪器:PB-10 普及型酸度 计,称量瓶,酸式滴定管,电热鼓风干燥箱,电 子天平,分析天平,磁力搅拌器,离心机。 双缩脲法主要仪器:755B 紫外可见分光光度 计,离心机,PB-10 普及型酸度计,分析天平, 10 mL 具塞玻璃试管。 凯氏定氮法主要仪器:250 mL 消化装置一套, 半微量凯氏定氮仪一套,酸式滴定装置一套。

3 测定方法
3.1 凯氏定氮法的检测方法 准确称取纯牛奶 30 g,边搅拌边用 10%的乙 酸溶液调 pH4.6,在 3000 r/min 条件下离心 15 min,所得沉淀物用蒸馏水洗涤两次分别在上述条 件下离心,取沉淀物用乙醚-乙醇等体积溶液洗涤 两次,分别离心,弃去上清液,所得沉淀物再用 乙醚溶液洗涤两次后抽滤,然后在 (100±2) ℃下烘 干至恒重,得到纯品酪蛋白干物质。 取纯品酪蛋白干物质 2~5 g 按 GB/T5009.52003 食品中蛋白质的测定方法测定其蛋白质含量, 其中酪蛋白的氮换算系数为 6.25。根据所得的蛋 白质含量计算出纯品酪蛋白干物质的纯度,然后 用如下公式即可计算出牛乳中酪蛋白质量分数。 酪蛋白质量分数=M0×C 式中:M0 为等电点沉淀法测得的纯品酪蛋白 干基的质量分数,%; C 为纯品酪蛋白干基的纯度。

3.2 双缩脲法的检测方法 标准曲线绘制:分别取酪蛋白标准液 0.0、 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于试管中,不足 1 mL 者用蒸馏水补齐至 1.0 mL,然后在各试管中加入4.0 mL 双缩脲试剂,混匀,室温下反应 30 min, 用 755B 紫外可见分光光度计在 540 nm 处测定吸 光值。以酪蛋白含量为横坐标,吸光值为纵坐标, 作标准曲线。 牛乳中酪蛋白的测定 准确吸取 10 mL 纯牛 奶,用 10%的乙酸溶液调 pH4.6 并在 3000 r/min 条 件下离心 15 min 沉淀酪蛋白,为防止酪蛋白沉淀 物中混有脂肪球而影响测定,沉淀再用 10 mL 乙 醚-乙醇混合液(体积比为 1∶1)洗涤并在上述条件下 离心,收集沉淀,用 0.1 mol/L 氢氧化钠溶解并准 确定容到 50 mL,取酪蛋白溶液 1.0 mL 加入 4 mL 双缩脲试剂,室温下反应 30 min,在 540 nm 处测 定吸光值,查对标准曲线,求得酪蛋白含量。

4 结果与讨论
4.1 标准曲线绘制的结果与讨论 经测定,绘制的标准曲线如图 1 所示。
由图 1 可以说明,用双缩脲法测定酪蛋白含 量时反应液中酪蛋白最终含量不得高于 2.0 mg/ mL,在此范围内,标准曲线的线性关系良好,相 关系数可达 0.999。但当酪蛋白含量超过 2.0 mg/ mL 时,曲线向下弯曲,会导致测定结果偏低。

4.2 不同牛乳样品的对比实验结果与讨论 不同牛乳样品分别用等电点沉淀法、双缩脲 检测法和凯氏定氮法进行检测,所得酪蛋白质量 分数见表 1。
由表 1 可以看出,双缩脲法测得的酪蛋白质 量分数比等电点沉淀法所得的纯品酪蛋白干物质的质量分数低约 6.37%。这主要是因为等电点沉淀 法所测得的纯品酪蛋白干物质是所有 pH 为 4.6 时 能够沉淀的物质,其中除了含有酪蛋白外,还含 有其他非酪蛋白杂质,虽然经过蒸馏水和有机溶 剂的洗涤提纯,除去了大部分的水溶性杂质和脂 类物质,但是经过凯氏定氮法的测定,其蛋白质 的含量大约为 86%。这说明,等电点沉淀法所测 得的纯品酪蛋白干物质中还含有很多杂质没有除 去,所以其测定值会偏高。 在等电点沉淀法分离牛乳中酪蛋白的基础上, 采用凯氏定氮法直接测定酪蛋白质量分数,所得 的酪蛋白数值比双缩脲法测得的结果低约 8.89%。 这主要是因为双缩脲法测定的蛋白质是碱性溶液 所能溶解的所有蛋白质,并且与双缩脲试剂反应 转化为络合物的显色部分。络合物颜色的深浅与 蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸 成分无关,用这种方法测得的蛋白质其中还含有 一些干扰物质,如硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基 酸等。因此,比色测定中读出的吸光度值,是可 溶于碱性溶液的所有蛋白质形成的有色络合物的 吸光度值,所以,用双缩脲法测得的酪蛋白质量 分数会比用凯氏定氮法测得的数值高一些。

5 结论 (1)双缩脲法测得的酪蛋白质量分数比凯氏定 氮法的结果高约 8.89%,但比纯品酪蛋白干基换算 的结果低约 6.37%。 (2)用双缩脲法测定牛乳中酪蛋白含量具有快 速、仪器简单、测定数值重现性好等特点。但是, 其测定的最终含量不得高于 2.0 mg/mL,当样品中 酪蛋白含量超过 2.0 mg/mL 时,会导致测定结果偏 低。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、Tris 缓 冲液和某些氨基酸等。 (3)用等电点沉淀法可以快速地测定出牛乳中 的粗品酪蛋白含量,但所得酪蛋白纯度不高,其 纯品酪蛋白干物质的蛋白质含量约为 86%。

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