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用凯氏定氮法测定食品中的蛋白质含量

[导读]:为了更加精确的运用凯氏定氮法检测分析食品中蛋白质的含量,本文分别用全量凯氏定氮法、微量凯氏定氮法和凯氏自动定氮仪来 测定了食品中的蛋白质的含量,结果发现用两种方法对同一样品中的蛋白质含量得出数值高低不同,全量凯氏定氮法的结果更加精确,微量法次之。

测定蛋白质的方法可分为两大类:一类是利用蛋白质的 物理化学性质来推算,如密度、折射率、紫外吸收、荧光性等; 另一类是利用化学方法来计算,如定氮、双缩脲反应、染料结 合反应、酚试剂反应等。 主要测定方法有:双缩脲法、染料结合法、酚试剂法、紫外 分光光度法、水扬酸比色法、折光法、旋光法、近红外光谱法。 目前蛋白质测定最常用的方法是凯氏定氮法,是通过测 总氮量来确定蛋白质含量的方法。 凯氏定氮法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应 的蛋白质系数而求出蛋白质的含量,此法的结果称为粗蛋白 质含量:由于样品中含有少量非蛋白质含氮化合物,如核酸、 生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化 合物.凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单 的方法之一,可用于所有动、植物食品的分析及各种加工食 品的分析,可同时测定多个样品,故国内外应用较为普遍,是 个经典分析方法[6]。至今仍被作为标准检验方法。此法可应用 于各类食品中蛋白质含量测定。 凯氏定氮法可分为全量法、微量法及经改进后的改良凯 氏定氮法。目前通常以硫酸铜作催化剂的常量、半微量、微量 凯氏定氮法样品质量及试剂用量较少,且有一套微量凯氏定 氮器。在凯氏法改良中主要的问题是,氮化合物中氮的完全 氨化问题及缩短时间、简化操作的问题,即分解试样所用的催 化剂。常量改良凯氏定氮法在催化剂中增加了二氧化钛[4]。 在理化实验室,检验食品中蛋白质的含量通常用微量凯 氏定氮法和全量凯氏定氮法。接下来以大量的试验来比较微 量凯氏定氮法和全量凯氏定氮法的精确度的大小。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验样品 肉禽制品(牛肉、马肉、荤饺子馅)、豆制品(豆腐乳)、调 味品(鸡精)、乳制品(纯牛奶)、糕点(面包)、植物蛋白饮料(椰汁)、冷饮及冰制品(雪糕、冰激淋)。

1.1.2 试验药品和试剂 所有试剂均为分析纯,水为蒸馏水或同等纯度的水。 硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸; 40%氢氧化钠溶液:称取40g氢氧化钠溶于60ml蒸馏 水中; 4%硼酸溶液:称取4g硼酸溶于蒸馏水中稀释至100ml; 0.1mol/l盐酸标准滴定溶液; 甲基红次甲基蓝混合指示液:将次甲基蓝乙醇溶液 (1g/l)与甲基红乙醇溶液(1g/l)按1∶2体积比混合。

1.1.3 仪器和设备 实验室常规仪器及下列各项: 凯氏烧瓶:500ml;可调式电炉;蒸汽蒸馏装置;绞肉机: 篦孔径不超过4nm;组织捣碎机;粉碎机;研钵:玻璃或瓷质; 化学消化器;凯氏定氮仪;空气滤过器。

1.2 试验方法

1.2.1 微量凯氏定氮法 微量凯氏定氮法的原理: 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解, 其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出,而样品中的有机氮 转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后取消化液的1/10加碱蒸 馏,使氨蒸出,用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴 定[2]。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。包括消化、 蒸馏、吸收、滴定4个步骤。

1.2.2 全量凯氏定氮法 全量凯氏定氮法的原理: 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解, 其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出,而样品中的有机氮 转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后取消化液的全部加碱蒸 馏,使氨蒸出,用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。 根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。包括消化、蒸馏、 吸收、滴定4个步骤。

2 分析过程 试样制备:固体样品:取有代表性的样品至少200g,用研钵捣碎、研细;不易捣碎、研细的样品应切(剪)成细粒;干固 体样品用粉碎机粉碎;液体样品:取充分混匀的液体样品至 少200g。粉状样品:取有代表性的样品至少200g(如粉粒较 大也应用研钵研细),混合均匀;糊状样品:取有代表性的样 品至少200g,混合均匀;固液体样品:按固、液体比例,取有代 表性的样品至少200g,用组织捣碎机捣碎,混合均匀;肉制 品:取去除不可食部分、具有代表性的样品至少200g,用绞肉 机至少绞2次,混合均匀。上述试样应放入密闭玻璃容器中, 于4°C冰箱内贮存备用,尽快测定。

2.1 微量凯氏定氮法的分析过程

2.1.1 样品消化 步骤:准确称取一定量的样品,加入硫酸铜0.5g、硫酸钾 10g 和浓硫酸 20ml、玻璃珠数粒→小心移入干燥洁净的 500ml凯氏烧瓶中(固体或粉沫用纸卷成纸筒送入),轻轻摇 匀,以45°斜支于有小孔的石棉网上→用电炉以小火加热 (或先烧瓶放在距电炉较远处),待内容物全部炭化、泡沫停 止产生后→加大火力(或将烧瓶放在电炉上),保持瓶内液体 微沸→至液体变蓝绿色透明后→继续加热微沸30min→关闭 电炉,取下烧瓶、冷却→转移至100ml容量瓶中,加水定容。

2.1.2 蒸馏与吸收 按图安装好微量定氮蒸馏装置。于水蒸气发生瓶内装水 至2/3容积处,加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升,以保持水 呈酸性,加入数粒玻璃珠。在接受瓶中加入10ml40g/l硼酸及 2滴混合指示剂,将冷凝管下端插入液面以下。准确吸取消化 液10ml于反应管内,经漏斗再加入10ml氢氧化钠溶液,用 少量蒸馏水冲洗漏斗,夹好漏斗夹并水封,加热煮沸水蒸气 发生瓶内的水进行蒸馏。指示剂变绿色后继续蒸馏10min,将 冷凝管尖端提离液面继续蒸1min。

2.1.3 滴定 将接受瓶内的硼酸液用0.01mol/l盐酸标准溶液滴定至 终点。同时做一试剂空白(除不加样品,从消化开始操作完全 相同)。

2.1.4 结果计算
式中: W—蛋白质的质量分数,%; c—盐酸标准溶液的浓度,mol/l; V1—空白滴定消耗标准液量,ml; V2—试剂滴定消耗标准液量,ml; m—样品质量,g; 0.014—氮的毫摩尔质量,g/mmol; F—蛋白质系数。 几类常见食物的蛋白换算系数见表1: 计算结果精确至小数点后第二位。 同一试样做两次平行试验,同时做空白试验。
2.2 全量凯氏定氮法的分析过程

2.2.1 样品消化 同 “微量法”。

2.2.2 蒸馏与吸收 同 “微量法”。在接受瓶中加入40ml40g/l硼酸及3滴混 合指示剂,将冷凝管下端插入液面以下。将全部消化液转移 于反应管内,加入125ml蒸馏水,摇匀后再加入40ml氢氧化 钠溶液,以下同“微量法”。

2.2.3 滴定 同“微量法”。

2.2.4 计算
2.3 自动凯氏定氮仪的分析过程

2.3.1 样品消化 准确称取一定量的样品,加入硫酸铜0.5g、硫酸钾10g 和浓硫酸20ml、小心移人与化学反映器配套的消化管内,置 于化学反映器上消化,同时打开空气过滤器,预约消化温度 为410°C,预约时间为180min。到达预约时间后,化学反映 器自动停止加热,冷却至室温。

2.3.2 蒸馏、吸收、滴定、计算 打开凯氏定氮仪和冷凝水开关,检查机器与试剂的连接 是否完好,将样品的质量和蛋白质系数输入系统,把装有冷 却消化液的消化管连接在凯氏定氮仪上,按下“ENTER”键, 约5min后,打印出此样品相关信息的屏条,将直接显示 样品中蛋白质的百分含量。

3 试验结果和分析 通过实验得到的蛋白质含量数据如下表2: 分析: 微量凯氏定氮法所测定的样品平行样间平均差别为:0.1208; 全量凯氏定氮法所测定的样品平行样间平均差别为:0.0353; 微量凯氏定氮法的测定结果与自动定氮仪的平均差别 为:0.7697; 全量凯氏定氮法的测定结果与自动定氮仪的平均差别 为:0.0523。
4 讨论

4.1 通过比较传统凯氏定氮法和凯氏自动定氮仪所测定出的食品的蛋白质含量可以看出,用传统的凯氏定氮法所测定 的蛋白质含量比凯氏自动定氮仪测出的结果偏低,前者两次 测定的同一食品的蛋白质含量差别较后者大,即样品的平行 性不够好,精密度不高,是由于在传统定氮的过程中存在着 样品消化液的转移,在转移的过程中有误差的存在,导致消 化液的流失,从而测定的数据稍偏低、差别较大。

4.2 通过比较传统凯氏定氮法中的微量凯氏定氮法和全量凯氏定氮法可以看出,后者的数据高于前者,精密度高于前 者,是由于前者在实验的过程中转移的次数较多,误差较大。

4.3 通过比较以上3组数据可以得知:凯氏定氮仪的的精密度最高,微量凯氏定氮法的最低;全量凯氏定氮法得到的 数据和凯氏定氮仪的数据差别较小,准确度高。

4.4 量取的样品倒入凯氏烧瓶时,不要将样品黏在瓶颈上, 以免加入消化液后试样炭化黏在瓶颈上消化不彻底。消化过 程中要逐渐升温,当低温加温至出现带有硫酸的白色气体 后,才可升温使溶液沸腾,但应避免剧烈沸腾。

4.5 消化液加蒸馏水稀释后,应及时蒸馏,否则应保存消化液,临用时再加蒸馏水稀释。反应室加入碱液后,应立即盖塞 并加水封,注意各接头处的密封情况,防止漏气。

4.6 蒸馏时,加入的氢氧化钠溶液除与硫酸铵作用外,还与 消化液中的硫酸和硫酸铜作用。若加入的氢氧化钠不够,则 溶液呈蓝色,不生成褐色的氢氧化铜沉淀。所以,加入的氢氧 化钠必须过量,并且动作还要迅速,以防止氨的流失。

4.7 蒸气发生瓶内的水装至2/3体积并且保持酸性(在蒸气 发生瓶内的水中加入稀硫酸,使之呈酸性,内加甲基橙指示 剂数滴,水应呈橙红色,如变黄时,应该补加酸),以防止在碱 性条件水中游离氨蒸出,使结果偏大。

4.8 因蒸馏时反应至外层的气压大于反应室内的压力,而 反应室的压力大于大气压力,故可将氨带出。所以,蒸馏时, 蒸气要均匀、充足,蒸馏中不得停火断气,否则,会发生倒吸。 停止蒸馏时,由于反应室外层的压力突然降低,可使液体倒 吸入反应室外层,所以,操作时,应先将冷凝管下端提高液面并清洗管口,再蒸1min后关掉热源。蒸馏是否完全,可用精 密pH试纸测冷凝管口的冷凝液来测定,中性则说明已蒸馏 完全。

5 结论

5.1 由于凯氏定氮法的误差,主要因消化操作的条件而产生,因此要格外注意。

5.2 全量凯氏定氮法的准确度和精密度比微量凯氏定氮法高,即精确度高。

5.3 凯氏自动定氮仪的误差较传统的凯氏定氮法小,精密度高,因而精确度最高。

5.4 在实际的生产实验中,凯氏定氮法作为一种国家标准, 应该严格按照标准的分析试剂、用量及分析过程来操作。

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