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Bradford法测定牛奶中蛋白质含量

[导读]采用Bradford法与传统的凯氏定氮法测定牛奶中蛋白 质含量并进行比较,Bradford法方便快捷,成本低廉。通过 试验对比验证,添加的尿素或者三聚氰胺对测定无影响,与 微量凯氏定氮法比较,两者的结果有相关性。

三聚氰胺事件引发的食品安全问题已经影响了整个食 品行业[ 1]。三聚氰胺又名假蛋白,属于非蛋白质含氮化合 物,属于难代谢物质,如果进入人和动物体内能不同程度的 导致肾衰竭或者死亡,还能导致结石诱发膀胱和泌尿系统疾 病[ 2],因此对牛奶中的蛋白质测定也提出了更高的要求。经 典的食品蛋白质(包括牛奶)含量的测定,方法繁琐,耗时长, 最关键的是样品中所有的含氮物质中所含的氮元素,都被转 换成硫酸铵,充当了蛋白质含量。因此导致了个别不法商家 向牛奶中添加含氮物质如尿素、三聚氰胺等,危害消费者的 身体健康[ 3, 4]。 牛奶中蛋白质的测定,一般使用凯氏定氮法,须经强酸 消化,然后蒸馏,再经滴定,方法繁琐,耗时长(约需2~3h); 而且凯氏定氮法测定的是样品中所有的含氮物质[ 5],无法区 分蛋白质氮还是非蛋白质氮[ 6, 7]。而采用Bradford法测定蛋 白质含量[ 8],步骤简单,耗时短(约需0.5h),并且考马斯亮 蓝试剂与尿素和三聚氰胺不发生显色反应,可用于牛奶中蛋白质含量的快速测定。 

1 材料与方法 

1.1 材料、试剂与仪器 牛奶:购于济南; 染色剂:考马斯亮蓝,称取100mg考马斯亮蓝 G-250 染料溶于50mL 95%的乙醇后,再加120mL 85%磷酸,用 水稀释定容到1L。 混合指示剂:10mL  1g/L的甲基红乙醇溶液与5mL 1g/L的亚甲基蓝乙醇溶液混合。 盐酸标准滴定液 :0.053 0mol /L。 标准蛋白质溶液:1.0mg/mL的牛血清白蛋白; 尿素、三聚氰胺、硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸、硼酸、氢氧化 钠、95%乙醇:皆为国产分析纯; 可见分光光度计:722N,上海精密科学仪器有限公司; 凯氏定氮仪:江苏江都市红旗玻璃厂; 分析天平:AR1140,奥豪斯国际贸易(上海)有限公司。 

1.2 方法 

1.2.1 样品、干扰品制备 用水将牛奶稀释得50倍牛奶稀 释样品;另取部分稀释液加入尿素使之浓度为0.2mg/mL, 再取部分稀释液加入三聚氰胺使之浓度为0.5mg/mL。 1.2.2 Bradford法操作步骤

( 1)标准曲线的制作:取7支试管,依次加入0,0.01, 0.02,0.04,0.06,0.08,0.10mL的1.0mg/mL标准蛋白质 溶液,用水补充到0.1mL,最后加入5.0mL考马斯亮蓝染 色剂,每加完1管立即混匀。反应2~5min后比色,以0管 调零,于595nm波长测定各管吸光度,并制作标准曲线。

( 2)待测管:取30支试管分为3组,第一组加入0.1mL 的50倍牛奶稀释样品,第二组加入0.1mL的尿素干扰样 品,第三组加入0.1mL的三聚氰胺干扰样品,测定吸光度。 根据标准曲线求得相应蛋白质含量。

1.2.3 凯氏定氮法操作步骤 取10支定氮瓶,分别加入 5.0mL牛奶,加硫酸铜0.2g,硫酸钾6g,硫酸20mL, 2粒 玻璃珠,瓶口置一漏斗,置于电热板上小心加热,待内容物完 全碳化,加大火力,消化至透明,继续加热半小时放冷,将消 化液定容至50mL。同时做空白。 向收集瓶内加入10.0mL硼酸溶液(20g/L)及2滴混 合指示液。取10mL消化液由小玻杯加入反应室,用10mL 水洗涤,再加10.0mL氢氧化钠溶液(400g/L),盖紧塞子, 加水密封,加紧旋夹,蒸馏10min。蒸馏液用0.053 0mol /L 盐酸滴定液滴定,计算出样品蛋白质含量。氮换算蛋白质系 数以6.38计。 1.2.4 精密度试验 取10支试管,分别加入0.1mL 50倍 牛奶稀释样品,用Bradford法测定吸光度,进行精密度试验, 通过标准曲线求得蛋白质含量以及结果的相对标准偏差。 

1.2.5 加标回收试验 分别取1.0mg/mL的蛋白质标准 溶液0.02,0.04mL,加入0.1mL 50倍牛奶样品稀释液,配 制成加标样品,用Bradford法测定,进行加标回收试验。 

2 结果与分析 

2.1 Bradford法标准曲线 以标准蛋白质质量为横坐标,吸光度为纵坐标绘制工作 曲线,回归方程见图1。

Fi gure   1 Standard curve 由图1标准曲线可知,采用Bradford法测定牛奶中蛋白 质含量时,蛋白质含量与吸光度成正相关。 

2.2 精密度试验 精密度试验结果见表1。 表1 精密度试验结果

Table   1 Accuracy of   the   regressive   curve /(mg·mL-

  由表1可知,10次测定结果的平均值为0.510 8mg /mL, RSD%为1.63,精密度良好。 

2.3 加标回收试验 由表2可知,平均回收率为101.04%,在95%~105% 范围内,表明此方法适于牛奶中蛋白质的测定。

2.4 尿素干扰试验 分别取尿素干扰样品溶液和三聚氰胺干扰样品溶液10 份,用Bradford法测定,结果见表3。 表3 三聚氰胺和尿素对Bradford法测定的干扰试验结果

Table   3 Interference   test   of Melamined & Urea 2.5 对比试验 用凯氏定氮法与Bradford法测定同一牛奶样品的质量 浓度,结果见表4。 表4 凯氏定氮法与Bradford法测定牛奶蛋白质含量结果由表4可知,凯氏定氮法与Bradford法的测定结果有偏 差,但又有规律性。凯氏定氮法的测定结果为Bradford法测 定结果的1.1倍。 

3 讨论 

设计试验之初,主要担心两点:① 牛奶样品的溶解状 态;② 尿素、三聚氰胺等含氮物质是否有干扰。 牛奶样品稀释 50 倍后,仍是乳白色溶液,测定时取 0.1mL样品,加入5mL显色液,此时的溶液完全清澈,符合 比色法的要求。 试验中按照牛奶内最大含氮量加入干扰物三聚氰胺或 尿素,结果显示,干扰物三聚氰胺或尿素,对吸光度无影响。 因此对于Bradford法而言,牛奶中添加三聚氰胺或尿素,无 法提高表观蛋白质含量,这是Bradford法与凯氏定氮法最大 的区别。 本法存在的问题是,所测定的蛋白质含量与凯氏定氮法 所测定的含量有一定偏差,经多次测定结果比较,将 Brad - ford法测定结果乘以1.1等于凯氏定氮法结果,目前,尚不 了解引起该偏差的原因。


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