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多功能酶标仪法测定饲料及原料中总磷的含量

[导读]现行GBT 6437—2018《饲料总磷的测定》中,检测饲料总磷含量采用的是分光光度法。原理为饲料中的总磷经酸消解,与钒钼酸铵生成黄色钒钼黄络合物,使用紫外可见分光光度计在波长400 nm下测定钒钼黄的吸光值与总磷浓度成正比,建立标准曲线比较定量。

国标法检测总磷所使用的分光光度计存在检测位置有限,加样量多且加样慢,检测大批量样品时需要不断清洗和干燥比色皿、操作烦琐、耗时长等问题;而多功能酶标仪单次可测定大量试样,且加样量少,可以更快速测定、节约时间、提高检测效率,能有效解决运用分光光度计检测的不足之处,为检验工作带来极大的方便。

1 试验材料:供试饲料样品,用自封袋密封并写上对应编号放入阴凉处保存,各取100 g样品经粉碎后过40目筛待测。

2 试验试剂:盐酸溶液:盐酸和蒸馏水按体积比1:3混合。钒钼酸铵显色剂:称取偏钒酸铵1.25 g加200 mL水加热溶解,冷却加入250 mL硝酸,另称取四水合钼酸铵26.55 g加400 mL水加热溶解。冷却后,将两者溶液混合,用水定容至1 000 mL,避光保存,出现沉淀则不能继续使用。磷标准贮备液(50 mg/L):精密称取105℃干燥至恒重冷却的磷酸二氢钾0.219 5 g,溶解于水,加入3滴硝酸并精确定容至1 000 mL,于聚乙烯瓶中保存。

3 试验仪器:紫外可见分光光度计;多功能酶标仪;实验室超纯水机;电子天平;移液器

4 试验原理:多功能酶标仪法和紫外可见分光光度计法的实验原理相同。破坏饲料试样中的有机物,使磷元素游离,在酸性条件下磷元素与钒钼酸铵显色剂反应结合生成黄色的钒钼黄络合物,其吸光值与总磷浓度成正比,在最大吸收波长处测量样品溶液吸光度,根据朗伯比尔定律,以吸光值为纵坐标,总磷浓度为横坐标绘制标准曲线,得到一元二次方程,再根据样品吸光值计算出总磷的浓度。

5 试验方法:1 波长选择与标准曲线绘制;根据GBT 6437—2018总磷的测定方法设置6个浓度梯度绘制磷标准曲线,用移液器分别移取0、1、2、5、10、15 mL磷标准溶液于50 mL容量瓶中(含磷量分别为0、50、100、250、500、750μg),各加入10 mL钒钼酸铵显色剂,用水稀释至刻度,摇匀,显色10 min待测。

国标法中紫外可见分光光度计法使用1 cm比色皿在400 nm波长下,以纯水为参比,测定溶液的吸光值。相关研究表明,总磷在分光光度计400~420 nm波长的检测下,其吸光值与标准磷溶液浓度均呈现较优的线性关系[1]。本试验选择酶标仪进行对比试验,为选择相对较佳的波长,同时使用400 nm与405 nm的滤光片,吸取标准样液于聚苯乙烯材料的96孔酶标板中,在上述2个波长下分别测定其标准溶液的吸光值,其结果如表1所示。酶标仪405 nm波长下,其吸光值与标准磷溶液的线性关系优于400 nm波长,故本试验中酶标仪选择405 nm与分光光度计400 nm进行对比试验。

标准曲线绘制方法:以吸光值为横坐标,磷含量为纵坐标,用EXCEL软件绘制吸光值关于磷浓度的标准曲线,并求出直线回归方程以及回归系数

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